三磷酸肌醇的制備及其生物活性的研究.pdf

1、本文以植酸為原料，采用酶法和非酶法水解植酸制備了具有生理活性的三磷酸肌醇。研究了不同來源的植酸酶的酶學(xué)性質(zhì)，植酸的水解條件，三磷酸肌醇分離純化方法，不同方法制備的三磷酸肌醇的結(jié)構(gòu)，并對三磷酸肌醇體內(nèi)外抗氧化，體內(nèi)對S180腫瘤生長的抑制作用和對荷瘤小鼠免疫能力的影響，體外對人肝癌SMMC-7721細胞的抑制作用及其對糖尿病小鼠的治療作用進行了研究。主要結(jié)果如下： 1土曲霉植酸酶與小麥麩皮植酸酶酶學(xué)性質(zhì)的研究通過鉬銻抗法測無機磷，

2、并以此為基礎(chǔ)建立了植酸酶酶活測定方法。土曲霉植酸酶反應(yīng)最適條件為pH5.10，溫度50℃，底物濃度為5mmol/L。鈣、鎂離子對該酶有激活作用，而無機磷對酶活有抑制作用，10mmol/L的無機磷對該酶的抑制作用為27％。土曲霉植酸酶的米氏常數(shù)Km為0.0528mmol/L。土曲霉植酸酶酶活達1.48*105U/g。 小麥麩皮植酸酶反應(yīng)最適條件為pH5.15，溫度37℃，底物濃度為2.5mmol/L，鈣、鎂離子對該酶有激活作用，而

3、無機磷對酶活有抑制作用，當(dāng)磷酸根離子濃度達到10mmol/L時，酶活有24％被抑制。小麥麩皮植酸酶的米氏常數(shù)Km為0.266mmol/L，酶活為1.8U/g麩皮。從麩皮中提取植酸酶時，最佳提取條件為麩皮與水的質(zhì)量比為1：6，提取溫度為5℃，時間為2h。小麥麩皮植酸酶在儲存時應(yīng)在低溫進行，37℃放置16h后，酶活只有剛透析出來的酶的酶活的83.2％。 2三磷酸肌醇的制備與分離植酸在小麥麩皮植酸酶最適水解條件下水解，當(dāng)水解度達到50

4、％時，水解混和液上717型強離子交換樹脂，0.05～0.7M鹽酸梯度洗脫，洗脫物分別取樣消化，檢測無機磷含量變化，并將同一峰值部分收集在一起，用NaOH中和，加CaCl2溶液，產(chǎn)生沉淀，過濾，沉淀用HCl溶解，上732型陽離子樹脂脫去鈣離子，蒸餾水洗脫，洗脫液用NaOH中和至中性后，減壓濃縮，冷凍干燥制得InsP3。用HPLC方法證明InsP3中無其他低磷酸肌醇，收率為28.4％。所得InsP3進一步用陰離子交換樹脂分離，得到了兩個In

5、sP3組分。 植酸經(jīng)土曲霉植酸酶水解，水解產(chǎn)物經(jīng)同樣方法處理，當(dāng)水解度為50％，收率為26％。所得InsP3進一步用陰離子交換樹脂分離，得到兩個InsP3組分。 用微波輻射方法水解植酸，當(dāng)水解度為50％，InsP3收率為18.4％。 由小麥麩皮植酸酶、土曲霉植酸酶、微波輻射方法制得的InsP3分別被命名為InsP3A、InsP3B、InsP3C。 3三磷酸肌醇的結(jié)構(gòu)分析采用1HNMR的方法研究表明，由小麥

6、麩皮植酸酶催化水解植酸，得到的InsP3主要是Ins(1，2，3)P3；由土曲霉植酸酶催化水解植酸，得到的InsP3主要是為Ins(1，2，6)P3。并首次單獨根據(jù)一維1HNMR譜圖對每個峰的歸屬進行了分析。 采用電噴霧質(zhì)譜分析了Ins(1，2，6)P3及Ins(1，2，3)P3的鈉鹽，在洲為4.0條件下，它們能夠結(jié)合不同個數(shù)的鈉離子而得到數(shù)種分子離子峰，而且Ins(1，2，6)P3與Ins(1，2，3)P3的裂解峰具有不同的特

7、點，裂解峰的產(chǎn)生主要通過失去一些片斷如H2O，PO，HPO3，HPO4，H3PO4和CO而得到，并首次對ESI質(zhì)譜圖進行了詳細的解釋。 分析了三磷酸肌醇的紅外光譜，紅外光譜表明該化合物中有O-H及C-O-P結(jié)構(gòu)。4三磷酸肌醇抗氧化性的研究 InsP3自身還原能力很弱，但具有很強的抑制·OH生成及很強的抑制小鼠血清活性氧的作用，三種方法得到的InsP3抑制·OH效果順序為：InsP3A＞InsP3C＞InsP3B。但在高濃

8、度時(0.4mg/mL)，三種InsP3對羥基的抑制率比較接近，分別為91.54％、90.78％、91.73％；但對小鼠血清活性氧的抑制率分別為91.78％、84.18％、91.18％。三磷酸肌醇之所以具有清除羥基自由的功能，可能是因為其所具有的絡(luò)合金屬離子的能力。 在高濃度(20mg/mL)時，三磷酸肌醇對大鼠紅細胞氧化自溶血具有促進作用；低濃度(2mg/mL)時具有明顯的抑制作用。無論是抑制效果還是促進作用以InsP3A與I

9、nsP3C較好。 通過小鼠腹腔注射InsP3(100mg/kg.d)，小鼠血清中抗活性氧能力增加。其中InsP3C顯著地抑制小鼠血清活性氧的產(chǎn)生。 三磷酸肌醇對小鼠肝勻漿體外溫育MDA的生成無明顯影響，但對H2O2誘導(dǎo)的小鼠肝勻漿MDA生成有一定的促進作用。 0.04％InsP3C抗油脂氧化能力比濃度為0.02％BHT好。 InsP3抗氧化作用機制是很復(fù)雜的，尤其在生命體系中，其作用機制可能不完全相同。

10、 5三磷酸肌醇對四氧嘧啶型糖尿病小鼠的治療作用研究InsP3可降低四氧嘧啶所致糖尿病小鼠的血糖值，并且以InsP3B效果最好，在濃度為50mg/Kg·d與100mg/Kg·d劑量時，可分別降低糖尿病小鼠血糖13.34％與30.89％，而且從肝、腎組織切片來看，三磷酸肌醇也具有一定的治療糖尿病小鼠的功能。 InsP3可提高正常小鼠與四氧嘧啶型糖尿病小鼠的胸腺與脾臟指數(shù)，并且以InsP3B效果最好，三磷酸肌醇降血糖功能可能與提

11、高小鼠免疫功能和抗氧化功能有關(guān)。 6三磷酸肌醇抑制小鼠S180腫瘤生長的作用植酸及三種方法制得的三磷酸肌醇都具有顯著抑瘤活性，并有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，抑瘤效果排序為：InsP3C＞植酸＞InsP3B＞InsP3A。高劑量(150mg/kg·d)時，InsP3A、InsP3B、InsP3C與InsP6抑制瘤率分別為：30.23％、32.56％、52.32％、34.88％。 三種方法制得的三磷酸肌醇能增加荷瘤小鼠免疫器官重

12、量；提高荷瘤小鼠遲發(fā)型超敏(DTH)反應(yīng)強度；提高小鼠血清溶血素IgM、IgG含量，并且以中劑量組效果最好；提高荷瘤小鼠脾細胞抗體形成能力，在高劑量(150mg/kg.d)時，各三磷酸肌醇組達到或接近正常對照組小鼠水平，并且以InsP3A效果最好。 提高小鼠紅細胞過氧化氫酶活力，高劑量時效果最好，并且三種方法得到的三磷酸肌醇中以InsP3B高劑量組最好，植酸效果比三磷酸肌醇差。 組織切片表明三磷酸肌醇或植酸無明顯使腫瘤細

13、胞壞死或炎癥增生而達到抑制腫瘤生長的作用。 三磷酸肌醇和植酸可能是通過其抗氧化性和提高小鼠的免疫能力來抑制腫瘤生長的。 7InsP3B對體外培養(yǎng)人肝癌細胞SMMC-7721的抑制作用MTT試驗結(jié)果表明，在試驗濃度范圍內(nèi)(50-700μg/mL)，InsP3B極顯著地抑制人肝癌SMMC-7721細胞株增殖，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)與時間-效應(yīng)關(guān)系，用700μg/mLInsP3B處理SMMC-7721細胞72h，細胞增殖抑制率為79

14、.08％。PCNA的實驗結(jié)果也印證了MTT試驗的結(jié)果。 AFP實驗表明，SMMC-7721細胞的惡性表達降低，細胞的形態(tài)學(xué)觀察也表明，InsP3B可能通過誘導(dǎo)SMMC-7721細胞向正常細胞分化而達到抑制SMMC-7721細胞的增殖。v通過用流式細胞儀檢測SMMC-7721細胞周期表明，InsP3B使SMMC-7721細胞周期被阻滯在G0/G1期，這也可能是導(dǎo)致SMMC-7721細胞增殖被抑制，進而促使SMMC-7721細胞分化