咖啡因?qū)ωi冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞K-,Ca-的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：鈣離子是細(xì)胞內(nèi)最重要的第二信使之一，對(duì)血管平滑肌張力的調(diào)節(jié)起重要作用。蘭尼定受體(ryanodinereceptor,RyR)及三磷酸肌醇受體(inositol-1,4,5-triphosphatereceptor,IP3R)是一類位于肌漿網(wǎng)膜上的主要的鈣離子釋放通道，其所介導(dǎo)的胞內(nèi)鈣庫(kù)鈣離子釋放對(duì)保持胞內(nèi)鈣的平衡和平滑肌的正常生理功能起著重要的作用。血管平滑肌細(xì)胞膜上鈣激活鉀通道(calcium-activatedpotassi

2、umchannels，KCa)分布廣泛，攜帶了70-80％的外向電流，KCa通道被激活后可引起細(xì)胞膜超極化，負(fù)反饋引起平滑肌舒張，反之，血管收縮，可見KCa在調(diào)節(jié)血管平滑肌張力機(jī)制中起重要作用?，F(xiàn)有研究表明：RyR被激活后，可引起肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)釋放鈣，導(dǎo)致局部鈣離子濃度升高(鈣火花)，激活KCa通道，調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞的張力。咖啡因(caffeine)可作用于RyR，引起鈣濃度的瞬變，進(jìn)而影響KCa通道。在多種動(dòng)物和多種細(xì)胞上已做過一些相關(guān)研究

3、，但作為與人心臟構(gòu)成相似的、容易獲得的研究對(duì)象—豬的冠狀動(dòng)脈，相關(guān)研究未見報(bào)道，其細(xì)胞內(nèi)肌漿網(wǎng)鈣庫(kù)激活后與KCa通道的關(guān)系及調(diào)控機(jī)理還不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用膜片鉗單通道電流記錄技術(shù)，采用內(nèi)面向外式(inside-out)、細(xì)胞貼附式(cell-attached)兩種方式研究咖啡因?qū)ωi冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞KCa通道的調(diào)控機(jī)理，及蘭尼定(ryanodine)對(duì)咖啡因激活的KCa通道作用的影響。 方法：分離豬冠狀動(dòng)脈，剔除內(nèi)外膜，保留

4、平滑肌層，縱行剖開后將其剪成2×5mm的組織塊，放入酶液經(jīng)過酶解后獲得單個(gè)平滑肌細(xì)胞，分離的細(xì)胞在8小時(shí)內(nèi)使用。取急性酶分離的平滑肌細(xì)胞置于對(duì)稱性高鉀溶液([K+]o：[K+]i=140：140mM)中，用膜片鉗技術(shù)記錄單通道電流，所得電流通過膜片鉗放大器(CEZ-2300)放大，濾波(1KHz)后輸入計(jì)算機(jī)，用PCLAMP9.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及分析。在細(xì)胞貼附式膜片和內(nèi)面向外式膜片上觀察不同濃度咖啡因?qū)Ca通道的影響以及在細(xì)胞

5、貼附式膜片上Ryanodine對(duì)caffeine激活KCa通道作用的影響。 結(jié)果：(1)在對(duì)稱性高鉀溶液中，內(nèi)面向外式膜片下，記錄到豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞KCa通道電導(dǎo)值為234.07±7.85pS(n=l5)，具有電壓依賴性及鈣敏感性；在outsiide-out膜片上，400nM的卡律蝎毒素(charybdotoxin，ChTX)能夠完全阻斷通道活動(dòng)。改變電極液和浴液的鉀離子梯度，記錄到的單通道電流具有明顯的鉀離子選擇性.(2)

6、在inside-out膜片上，0.1、0.5、1.0、5.0mM咖啡因?qū)Ca通道具有明顯的激活作用，隨著濃度增加，KCa通道的開放概率(openprobability,NPo)也增加，呈現(xiàn)出濃度依賴性。另外，KCa通道平均關(guān)閉時(shí)間也隨著濃度增加而明顯縮短。5.0mM左右咖啡因?qū)Ca激活程度最大，用不含藥物的浴液洗脫后，通道的活性可以恢復(fù)到接近用藥前水平，再加入咖啡因(0.5mM)仍可再次激活KCa，說明咖啡因和作用位點(diǎn)結(jié)合是可逆的。

7、浴液鈣離子濃度接近0mM([EGTA]=1mM，[Ca2+]=0mM)時(shí)，咖啡因?qū)Ca通道仍有激活作用，提示在內(nèi)面向外式構(gòu)型上咖啡因激活KCa通道作用與鈣離子是否存在關(guān)系不大。(3)在cell-attached膜片上，當(dāng)咖啡因達(dá)到一定濃度時(shí)，KCa通道被激活，咖啡因濃度(0.1-5.0mM)增加，NPo也增加，呈現(xiàn)出濃度依賴性，開放時(shí)間延長(zhǎng)，關(guān)閉時(shí)間也隨之縮短，5.0mM左右咖啡因可最大程度激活KCa通道，用不含藥物的浴液洗脫后，通道

8、活性可一定程度的恢復(fù)，再加入一定濃度咖啡因(如1.0mM)可再次激活KCa，激活程度與洗脫前較接近。(4)Ryanodine對(duì)咖啡因激活KCa作用的影響：在cell-attached膜片上，加入咖啡因明顯激活KCa通道后，再加入不同濃度的Ryanodine(10、20、40μM)，隨著濃度增加，KCa通道NPo減少，關(guān)閉時(shí)間(timeofclosuer,Tc)延長(zhǎng)，開放時(shí)間(opentime，To)縮短。 結(jié)論：(1)在內(nèi)面向外

9、式構(gòu)型上，咖啡因能直接激活豬冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞KCa通道，有飽和性，這種作用與鈣離子的濃度變化關(guān)系不明顯。(2)在細(xì)胞貼附式構(gòu)型上咖啡因濃度依賴性地激活KCa，增加開放概率，延長(zhǎng)開放時(shí)間，但主要是縮短關(guān)閉時(shí)間，對(duì)KCa的作用有飽和性。Ryanodine可以濃度依賴性地抑制KCa活性，使NPo減少，To縮短，但主要是延長(zhǎng)關(guān)閉時(shí)間。表明咖啡因、Ryanodine可通過影響胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程而影響KCa活性，或說明二者可能通過共同的靶點(diǎn)(RyR