miRNA-25靶向調(diào)控ANGPTL2抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的研究.pdf

1、背景:
　　結(jié)直腸癌的發(fā)病率處于惡性腫瘤的第三位，隨著人們飲食習(xí)慣和結(jié)構(gòu)的改變及人口的老齡化，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢。由于結(jié)直腸癌的早期癥狀不明顯，一旦確診大部分已屬中、晚期，5年總生存率徘徊在50％左右。結(jié)直腸癌以手術(shù)治療為主，配合化療、放療、靶向治療等綜合治療手段。結(jié)直腸癌的發(fā)生與多基因異常表達(dá)有關(guān)，調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生過程中某些關(guān)鍵基因的表達(dá)以阻斷惡性轉(zhuǎn)化，是控制腫瘤的有效手段之一。目前結(jié)直腸癌最為主要的靶點(diǎn)是血管內(nèi)皮生長因子(

2、Vascular endothelial growth factor，VEGF)和表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor EGFR)，貝伐單抗和西妥昔單抗聯(lián)合化療在晚期結(jié)直腸癌中顯示較好的臨床療效。尋找結(jié)直腸癌新的關(guān)鍵致癌基因和信號傳導(dǎo)通路的分子靶標(biāo)，研究靶向藥物，可能是未來結(jié)直腸癌靶向治療的突破點(diǎn)之一。
　　血管生成樣蛋白2(Angiopoietin-like protein2，ANG

3、PTL2)是新近發(fā)現(xiàn)的一種分泌型細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，屬于血管生成樣蛋白家族成員。ANGPTL2能夠被慢性缺氧所誘導(dǎo)，并參與誘導(dǎo)血管生成和血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。ANGPTL2蛋白與炎癥、肥胖和胰島素抵抗密切相關(guān)。ANGPTL2在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Ⅱ型糖尿病、冠狀動脈疾病和惡性腫瘤等疾病過程中扮演著重要作用。到目前為止，ANGPTL2蛋白在惡性腫瘤中的表達(dá)、作用機(jī)制、上游調(diào)控基因等國內(nèi)外罕見報道。
　　MiRNA（microRNA）是具有2

4、2個核苷酸長度的小分子非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄水平上通過降解或者抑制mRNA的翻譯調(diào)控了大約30％的人類基因的表達(dá)。MiRNA參與調(diào)控了一系列的細(xì)胞事件包括細(xì)胞增殖、發(fā)育、細(xì)胞代謝和凋亡等功能。因此，miRNA的功能失調(diào)將導(dǎo)致惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miRNA-25在多種人類惡性實(shí)體瘤包括胃癌、食管鱗狀細(xì)胞癌、肝癌和胰腺癌中表達(dá)上調(diào)。miRNA-25既能夠作為癌基因又能作為腫瘤抑制基因，因此其功能非常復(fù)雜。miRNA-25在結(jié)腸癌中的作用及其

5、是否參與對ANGPTL2的調(diào)控值得深入研究，為結(jié)腸癌的基因治療提供潛在的分子靶標(biāo)。
　　第一部分 ANGPTL2結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床意義
　　目的:
　　檢測ANGPTL2在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平，探討ANGPTL2的表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性。
　　方法:
　　(1)利用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測50例結(jié)腸癌組織和相應(yīng)的50例癌旁正常組織中ANGPTL2蛋白的表達(dá)水平，統(tǒng)計分析ANGPTL2的表

6、達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的相關(guān)性。
　　(2)通過real-time PCR和western blot方法檢測ANGPTL2在正常腸上皮細(xì)胞株HCEpic和結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116、HT-29、SW480和SW620中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　(1)ANGPTL2蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較癌旁正常組織中的表達(dá)明顯升高，且ANGPTL2蛋白的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的病理分級、T分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

7、P＜0.05)。
　　(2) ANGPTL2的mRNA和蛋白表達(dá)水平在結(jié)腸癌細(xì)胞株明顯高于正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞株，且在高侵襲性結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和SW620中的表達(dá)明顯高于低侵襲性結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29和SW480。
　　結(jié)論:
　　ANGPTL2在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)均明顯升高，且ANGPTL2的表達(dá)與結(jié)腸癌的病理分級、T分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示ANGPTL2在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用

8、。
　　關(guān)鍵詞:結(jié)腸癌;ANGPTL2;miRNA-25;細(xì)胞增殖;細(xì)胞侵襲
　　第二部分 ANGPTL2對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響
　　目的:
　　觀察調(diào)控ANGPTL2的表達(dá)對結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力等生物學(xué)行為的影響。
　　方法:
　　(1)構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)的過表達(dá)載體Lv-ANGPTL2和干擾載體Lv-ANGPTL2-shRNA。將載體分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和SW620，并

9、篩選得到穩(wěn)定ANGPTL2過表達(dá)細(xì)胞克隆(HCT-116/Lv-ANGPTL2和SW620/Lv-ANGPTL2)和穩(wěn)定ANGPTL2干擾細(xì)胞克隆(HCT-116/Lv-ANGPTL2-shRNA和 SW620/Lv-ANGPTL2-shRNA)。Real-time PCR和western blot方法檢測ANGPTL2的上調(diào)和沉默效果
　　(2) MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)ANGPTL2細(xì)胞克隆和干擾ANGPTL2細(xì)胞克隆的

10、增殖能力。
　　(3) Transwell小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)ANGPTL2細(xì)胞克隆和干擾ANGPTL2細(xì)胞克隆的侵襲能力。
　　結(jié)果:
　　(1)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾和過表達(dá)克隆技術(shù)成功沉默和上調(diào)人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和SW620中ANGPTL2的表達(dá)，并建立了穩(wěn)定沉默和過表達(dá)ANGPTL2的細(xì)胞系。
　　(2)感染ANGPTL2過表達(dá)慢病毒（Lv-ANGPTL2-shRNA）進(jìn)入HCT-1

11、16和SW620細(xì)胞后，MTT增長曲線顯示兩種細(xì)胞株在24h、48h和72h的細(xì)胞增殖速度明顯快于Lv-NC（空載體）組和對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。感染ANGPTL2干擾慢病毒(Lv-ANGPTL2-shRNA)進(jìn)入HCT-116和SW620細(xì)胞后，MTT增長曲線顯示兩種細(xì)胞株在24h、48h和72h的細(xì)胞增殖速度明顯慢于Lv-NC組和對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　(3)過表達(dá)HCT-116/

12、Lv-ANGPTL2細(xì)胞克隆、HCT-116/Lv-NC細(xì)胞克隆和對照HCT-116細(xì)胞的克隆形成率分別為78±2.65％、61.3±7.51％和62.3±6.03％;過表達(dá)SW620/Lv-ANGPTL2細(xì)胞克隆、SW620/Lv-NC細(xì)胞克隆和對照SW620細(xì)胞的克隆形成率分別為84.3±3.06％、67.3±8.50％和68.3±5.51％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。干擾HCT-116/Lv-ANGPTL2-shRNA細(xì)

13、胞克隆、HCT-116/Lv-NC-shRNA細(xì)胞克隆和對照HCT-116細(xì)胞株的克隆形成率分別為38.3±3.79％、64.7±3.51％和63±4.58％;干擾SW620/Lv-ANGPTL2-shRNA細(xì)胞克隆、SW620/Lv-NC-shRNA細(xì)胞克隆和對照SW620細(xì)胞的克隆形成率分別為42.7±4.04％、64.3±5.03％和69.7±5.57％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　(3)Transwell實(shí)驗(yàn)

14、顯示穩(wěn)定感染過表達(dá)Lv-ANGPTL2的HCT-116細(xì)胞和SW620細(xì)胞侵襲能力明顯高于穩(wěn)定感染Lv-NC組和對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。感染Lv-ANGPTL2-shRNA的HCT-116細(xì)胞株和SW620細(xì)胞株侵襲能力明顯低于感染Lv-NC-shRNA和對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05）。
　　(4)顯示細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，相比Lv-NC組和空白組，穩(wěn)定感染過表達(dá)Lv-ANGPTL2組的HCT-116細(xì)

15、胞和SW620細(xì)胞到24h時，劃痕的間距明顯減小，到48h時候，間距幾乎消失;穩(wěn)定感染干擾Lv-ANGPTL2-shRNA組的HCT-116細(xì)胞和SW620細(xì)胞在24h和48h時，細(xì)胞劃痕的間隙明顯增大。
　　結(jié)論:
　　(1)慢病毒載體介導(dǎo)的ANGPTL2shRNA干擾序列和ANGPTL2cDNA過表達(dá)克隆序列對HCT-116和SW620細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)染效率，并可以沉默和上調(diào)ANGPTL2在HCT-116和SW620細(xì)胞中的

16、表達(dá)。
　　(2) MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)證明ANGPTL2促進(jìn)了人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和SW620細(xì)胞的增殖。
　　(3) Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明ANGPTL2促進(jìn)了人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和SW620細(xì)胞的侵襲能力。
　　關(guān)鍵詞:結(jié)腸癌;ANGPTL2;miRNA-25;細(xì)胞增殖;細(xì)胞侵襲
　　第三部分 MiRNA-25通過靶向ANGPTL2抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲
　　

17、目的:
　　探討miRNA-25對結(jié)腸癌細(xì)胞中ANGPTL2的調(diào)控作用以及對細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。
　　方法:
　　(1)通過生物信息學(xué)軟件TargetScan，分析了人ANGPTL2基因mRNA的3'非翻譯區(qū)，尋找潛在的miRNA-25結(jié)合位點(diǎn)。
　　(2)通過real-time PCR和western blot檢測在HCT-116和SW620細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-25和轉(zhuǎn)染miRNA-25抑制物后，細(xì)胞

18、中ANGPTL2 mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化。
　　(3)分別將野生型以及突變miRNA-25結(jié)合位點(diǎn)的ANGPTL2mRNA的3'非翻譯區(qū)克隆進(jìn)入報告基因載體psi-CHECK2，通過熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)檢測野生型報告基因載體ANGPTL2-3'UTR-psi-CHECK2和突變型報告基因載體Mut-ANGPTL2-3'UTR-psi-CHECK2的熒光素酶活性。
　　(4)通過MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miRNA-

19、25或miRNA-25抑制物對HCT-116和SW620細(xì)胞增殖的影響。
　　(5)通過Transwell小室實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miRNA-25或miRNA-25抑制物對HCT-116和SW620細(xì)胞的侵襲能力的影響。
　　結(jié)果:
　　(1)通過生物信息學(xué)軟件TargetScan，在人ANGPTL2基因mRNA的3'非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)了一個潛在的miRNA-25結(jié)合位點(diǎn)。
　　(2)在HCT-116和SW62

20、0細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-25，顯著降低了細(xì)胞中的ANGPTL2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平;而分別轉(zhuǎn)染miRNA-25抑制物進(jìn)入HCT-116和SW620細(xì)胞明顯上調(diào)了細(xì)胞中ANGPTL2 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。
　　(3) miRNA-25能夠顯著抑制野生型報告基因載體ANGPTL2-3'UTR-psi-CHECK2的熒光素酶活性，而對突變型報告基因載體Mut-ANGPTL2-3'UTR-psi-CHECK2的熒光素酶活性沒

21、有影響。
　　(4)相比轉(zhuǎn)染pre-con和對照組，轉(zhuǎn)染pre-miRNA-25后的72h之內(nèi)，HCT-116和SW620細(xì)胞的增殖速度明顯減慢。轉(zhuǎn)染anti-miRNA-25及對照物進(jìn)入HCT-116和SW620細(xì)胞后72小時之內(nèi)，相比對照物組和空白對照組，anti-miRNA-25顯著的促進(jìn)了這兩株人結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖能力。
　　(5)在HCT-116細(xì)胞中，空白對照組、轉(zhuǎn)染pre-con組和轉(zhuǎn)染pre-miRNA-25

22、形成的克隆數(shù)目分別為61.00±7.55、69.67±5.69和43.0±4.00;在SW620中，空白對照組、轉(zhuǎn)染pre-con組和轉(zhuǎn)染pre-miRNA-25形成的克隆數(shù)目分別為65.67±3.51、64.67±7.51和48.0±3.61，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在HCT-116細(xì)胞中，空白對照組、轉(zhuǎn)染anti-con組和轉(zhuǎn)染anti-miRNA-25形成的克隆數(shù)目分別為60.30±5.69、60.00±3.61和78

23、.3±4.51;在SW620中，空白對照組、轉(zhuǎn)染anti-con組和轉(zhuǎn)染anti-miRNA-25形成的克隆數(shù)目分別為67.67±3.51、66.67±8.14和81.0±4.00，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(6) Transwell實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染pre-miRNA-25進(jìn)入HCT-116細(xì)胞株和SW620細(xì)胞株后的細(xì)胞侵襲能力明顯低于空白和轉(zhuǎn)染對照miRNA的HCT-116或SW620細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P

24、＜0.05)。轉(zhuǎn)染anti-miRNA-25進(jìn)入HCT-116細(xì)胞株和SW620細(xì)胞株后的細(xì)胞侵襲能力明顯高于空白和轉(zhuǎn)染對照miRNA的HCT-116和SW620細(xì)胞株，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(7)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，相比空白對照和轉(zhuǎn)染pre-con組，轉(zhuǎn)染pre-miRNA-25的HCT-116細(xì)胞和SW620細(xì)胞在24h和48h時的劃痕間距明顯增大。相比空白對照和anti-con轉(zhuǎn)染組，轉(zhuǎn)染pre-miRNA

25、-25的HCT-116細(xì)胞和SW620細(xì)胞在24和48h時的劃痕間距明顯縮小。
　　結(jié)論:
　　(1) MiRNA-25能夠直接結(jié)合到ANGPTL2 mRNA的3'非翻譯區(qū)的miRNA-25結(jié)合位點(diǎn)負(fù)調(diào)控HCT-116和SW620細(xì)胞中ANGPTL2基因的表達(dá)。
　　(2).MiRNA-25通過靶向負(fù)調(diào)控ANGPTL2的表達(dá)抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，暗示miRNA-25/ANGPTL2途徑可能成為診斷和治療結(jié)腸