基于C-Met基因沉默聯(lián)合化療抑制結腸癌細胞增殖、遷移的研究.pdf

1、結直腸癌是全世界發(fā)病率排名第三的惡性腫瘤，每年有超過100萬患者確診為結直腸癌，且約有60萬人死于結直腸癌，其總的5年生存率僅為50-70％。結直腸癌主要通過脈管方式（淋巴管和血管）向遠處轉(zhuǎn)移，部分患者在就診時已出現(xiàn)淋巴結及血管轉(zhuǎn)移，這些結直腸癌患者的預后較差。早、中期結直腸癌的治療手段仍然以手術治療為主，而中、晚期結直腸癌則以放化療為基礎聯(lián)合靶向藥物治療為主要手段。目前以血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和表皮生長因子受體(EGFR)為靶點

2、的兩類靶向藥物在結直腸癌臨床治療中得到了廣泛的應用，并取得了可喜的效果，但是原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥的問題嚴重影響了靶向藥物的臨床療效。
　　 c-Met是由原癌基因c-met編碼的是一類重要的酪氨酸激酶受體，在結直腸癌細胞中過量表達，且與腫瘤增殖、遷移、侵襲、腫瘤血管形成及肝轉(zhuǎn)移密切相關。其特異性配體為肝細胞生長因子/離散因子(HGF/SF)。臨床證據(jù)顯示，65％結腸癌原發(fā)灶或者轉(zhuǎn)移灶組織中的c-Met的表達水平明顯高于正常的結腸黏

3、膜上皮組織，且外周血血清中和腫瘤組織中的HGF表達水平明顯升高。這些證據(jù)提示了c-Met可以成為結直腸癌治療的重要靶點，也使得對基于c-Met的分子靶向治療聯(lián)合傳統(tǒng)放化療在結直腸癌上抗腫瘤活性和作用機制的探討至關重要。
　　 在前期實驗中我們采用慢病毒介導的可調(diào)控誘導小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)技術，在人結腸癌細胞SW620上建立穩(wěn)定可調(diào)控細胞系，抑制c-met基因的表達。適當沉默c-Met

4、后，SW620的增殖明顯低于對照組。本實驗則繼續(xù)探討:適當沉默c-Met后聯(lián)合傳統(tǒng)化療對人結腸癌細胞SW620的增殖及遷移的影響。
　　 目的:將構建成功含有人c-Met基因可調(diào)控shRNA的重組質(zhì)粒進行慢病毒包裝，感染SW620細胞并篩選出穩(wěn)定可調(diào)控誘導的細胞系。探討適當敲除c-Met后聯(lián)合化療對SW620細胞增殖、遷移的影響。
　　 方法:
　　 1.將pMDL、pRSV、VSVG輔助質(zhì)粒及重組的pSD400

5、-c-Met-shRNA質(zhì)粒按一定比例混合，在Megatran1.0介導下，共轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝，收集病毒液并感染SW620細胞，利用嘌呤霉素(puromycin)篩選出穩(wěn)定表達針對c-met的shRNA的細胞株。
　　 2.用多西環(huán)素(Doxycycline)誘導穩(wěn)定細胞系，用Western-blot和免疫熒光的方法，在蛋白水平檢測穩(wěn)定可調(diào)控細胞系c-Met的表達量。
　　 3.利用Transwell的方法，

6、檢測適當敲低c-Met后SW620細胞的遷移能力。
　　 4.利用alamar-Blue和Colonyformation的方法，檢測c-Met敲低后聯(lián)合化療藥對SW620細胞增殖的抑制。
　　 結果:
　　 1.用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T進行慢病毒包裝，收集48小時的病毒感染SW620細胞24小時，加嘌呤霉素篩選一周，然后將形成的單克隆擴大培養(yǎng)。
　　 2.免疫熒光法結果顯示，400nM多西環(huán)素可明顯抑制pSD

7、400-c-Met-shRNA-SW620細胞中c-Met的表達。
　　 3.用不同濃度（0、1、10、100、400、1000nM）的多西環(huán)素(DOX)誘導pSD400-c-Met-shRNA-SW6203天，Western-blot檢測c-Met表達量隨DOX濃度的增加而逐漸下降。用400nM的DOX誘導穩(wěn)定細胞系3天，Confocal檢測c-Met的表達量較未誘導組明顯下降。成功構建穩(wěn)定可調(diào)控細胞株。
　　 4.T

8、ranswell檢測到適當敲低c-Met后，遷移到小室下面的SW620細胞的數(shù)目較未敲低c-Met組減少。
　　 5.用Colonyformation方法檢測適當敲低SW620細胞的c-Met表達后聯(lián)合5-Fu、Taxol，細胞克隆形成較未敲低組少。
　　 6.用alamar-Blue的方法測適當敲低SW620細胞的c-Met表達后聯(lián)合5-Fu對細胞的增殖抑制能力增強。
　　 結論:
　　 1.成功構建針