載阿霉素組氨酸修飾透明質(zhì)酸納米粒的制備及抗腫瘤研究.pdf

1、透明質(zhì)酸（HA）是一種天然多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性，已在藥物輸送和組織工程等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。本論文合成了組氨酸修飾透明質(zhì)酸耦合物，應(yīng)用超聲分散法制備載阿霉素納米粒，進(jìn)行細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝入過程分析，以H22荷瘤小鼠為模型，闡明其藥代動力學(xué)、組織分布以及抑瘤活性。
　　首先，以組氨酸（His）為配基，通過酰胺接枝反應(yīng)合成了不同取代度的組氨酸修飾透明質(zhì)酸耦合物（His-HA）；應(yīng)用核磁共振法耦合物的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行了表征

2、，利用熒光光譜法分測定 His-HA耦合物的臨界聚集濃度（CAC），并分析不同pH值下耦合物的微結(jié)構(gòu)變化。1H NMR圖譜顯示His成功地修飾到HA上；熒光圖譜顯示His-HA耦合物的CAC隨著His取代度的升高而降低。
　　利用超聲波分散法制備 His-HA納米粒，應(yīng)用動態(tài)激光散射儀測量 His-HA納米粒的粒徑分布和Zeta電位，并分析pH值對粒徑、Zeta電位的影響，利用透射電鏡對納米粒形態(tài)進(jìn)行形態(tài)觀察。結(jié)果顯示，隨著His

3、取代度的升高，His-HA納米粒的平均粒徑從780±56 nm下降到230±21 nm，另外，隨著pH值的降低，His-HA粒徑升高，顯示His-HA納米粒具有pH響應(yīng)性。His-HA納米粒的Zeta電位呈現(xiàn)負(fù)電性，其絕對值隨著His取代度的升高而降低，隨著溶液介質(zhì)pH值的降低，納米粒的Zeta電位絕對值降低。電鏡圖片顯示His-HA納米粒外觀似球形，形態(tài)完整。
　　以阿霉素（DOX）為模型藥物，制備了包載 DOX的His-HA納

4、米粒（DOX/His-HA），分析其載藥量、包封率及體外釋藥規(guī)律。結(jié)果證明，隨著取代度的提高，納米粒的包封率增加，載藥量增大。體外釋藥實(shí)驗(yàn)顯示，載藥納米粒具有緩釋效果，隨著取代度增加，緩釋效果增強(qiáng)；在酸性條件下，DOX/His-HA納米粒的釋藥量增加，在pH6.0時(shí)，8 h累計(jì)釋藥率高達(dá)32.92％，48 h累計(jì)釋藥率高達(dá)51.87%。
　　MTT法考察了DOX/His-HA納米粒對MCF-7細(xì)胞的毒性。制備FITC標(biāo)記的納米粒（

5、FITC-His-HA），分析 FITC-His-HA納米粒的細(xì)胞攝入特征。另外，探討溫度、pH值以及HA因素對MCF-7細(xì)胞攝入的影響。研究結(jié)果顯示：隨著DOX濃度的增加，自由DOX和DOX/His-HA納米粒對MCF-7細(xì)胞的抑制率增加，細(xì)胞毒性也不斷提高，呈現(xiàn)了藥物濃度與作用時(shí)間的響應(yīng)性。細(xì)胞攝入實(shí)驗(yàn)顯示，F(xiàn)ITC-His-HA納米粒被MCF-7細(xì)胞攝??；DOX/His-HA納米粒被細(xì)胞攝入，分散于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中。定量實(shí)驗(yàn)顯示：

6、在4℃下，MCF-7細(xì)胞對DOX的攝入量降低，但隨著pH的降低，細(xì)胞攝入量增加。這說明細(xì)胞對DOX的攝取方式存在兩種方式：受體介導(dǎo)的載藥納米粒的胞吞、載藥納米粒在胞外釋放的DOX。競爭性細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)顯示：經(jīng) HA預(yù)處理后，MCF-7細(xì)胞對載藥納米粒的攝取量降低，說明DOX/His-HA納米粒選擇性地結(jié)合到CD44受體，并通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用被MCF-7細(xì)胞攝入。
　　對His-HA納米粒的生物相容性進(jìn)行了分析，評價(jià)了His-HA

7、納米粒的細(xì)胞相容性、血液相容性。以人肝細(xì)胞L02為細(xì)胞模型，采用MTT法考察His-HA納米粒的細(xì)胞毒性，通過溶血實(shí)驗(yàn)評價(jià)了His-HA納米粒的血液相容性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：His-HA納米粒具有較好的細(xì)胞相容性和血液相容性，滿足醫(yī)用生物材料的要求。
　　以H22荷瘤小鼠為動物模型，考察DOX/His-HA納米粒的藥代動力學(xué)和組織分布規(guī)律，并評價(jià)了其肝癌靶向性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與DOX對照組相比，DOX/His-HA納米粒組的t1/2β

8、、AUC明顯增加，MRT明顯延長，而CL與Vc則明顯降低。組織分布實(shí)驗(yàn)顯示：與DOX對照組相比，DOX/His-HA納米粒經(jīng)尾靜脈注射后，在腫瘤組織的DOX含量明顯增加，顯示具有腫瘤靶向性，并且隨著取代度的增加，腫瘤靶向性增強(qiáng)。
　　以H22荷瘤小鼠為動物模型，以生理鹽水為對照，考察DOX、DOX/His-HA納米粒的抑瘤效果。對小鼠體重而言，DOX給藥組的小鼠體重較對照組明顯減輕(P<0.05)，DOX/His-HA納米粒給藥組

9、的小鼠體重較對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；從抑瘤效果上，DOX和DOX/His-HA納米粒給藥后，腫瘤生長都得到抑制，其中，DOX/His-HA納米粒給藥組的抑瘤率為67.07%，與生理鹽水組差異明顯（P<0.01）。而在小鼠免疫力影響方面，與對照組相比，DOX/His-HA納米粒給藥組小鼠的胸腺指數(shù)，脾臟指數(shù)均沒有明顯差異（P>0.05）。而DOX給藥組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)明顯降低（P<0.05）。這說明DOX/His-HA納米粒