清熱化瘀顆粒對大鼠腦缺血預(yù)處理后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ATF6、GADD153表達(dá)的影響.pdf

1、目的:觀察清熱化瘀顆粒對大鼠腦缺血預(yù)處理后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ATF6、GADD153表達(dá)的影響，探討清熱化瘀顆粒預(yù)處理對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)元保護(hù)作用。
　　 方法:將200只大鼠隨機(jī)分為五組，即假手術(shù)組(sham-operation，SO);MCAO組:假手術(shù)+腦缺血組（SO+MCAO）;BIP組:預(yù)缺血+腦缺血組（BIP+MCAO）;QRHY組:預(yù)缺血+清熱化瘀顆粒+腦缺血組(BIP+QRHY+MCAO);QKL對照組:預(yù)缺血+清

2、開靈顆粒+腦缺血組(BIP+QKL+MCAO)，每組40只。每組按照再缺血后12h、1d、2d、3d四個(gè)時(shí)間點(diǎn)平均分為4個(gè)亞組(n=10)。采用大鼠大腦中動脈二次線栓法制備大鼠腦缺血預(yù)處理模型，分別作如下處理:假手術(shù)組（SO組）:以假手術(shù)代替預(yù)缺血及缺血再灌注，線栓只插入頸內(nèi)動脈9mm，然后正常飼養(yǎng)，自由飲水;MCAO組:以假手術(shù)代替預(yù)缺血，其余步驟同腦缺血預(yù)處理組，動物造模后正常飼養(yǎng)，自由飲水，灌胃等體積的生理鹽水;BIP組:MCAO

3、10min后抽出栓線，完成預(yù)缺血;3d后再次行MCAO2h，灌胃等量生理鹽水，再灌注后12h、1d、2d、3d處死;QRHY組:缺血預(yù)處理10min后，在大鼠麻醉清醒后1h灌胃清熱化瘀顆粒溶液，連續(xù)3d，每天上、下午各一次。3d后給予2hMCAO，再灌注后12h、1d、2d、3d處死;QKL對照組:以灌胃清開靈湯顆粒溶液代替清熱化瘀顆粒溶液，余操作步驟同QRHY組。造模后取材，常規(guī)HE染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察各組腦組織病理形態(tài)學(xué)改變，采

4、用免疫組化檢測ATF6、GADD153蛋白在大鼠缺血半暗帶表達(dá)的變化。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ATF6的mRNA水平在大鼠缺血半暗帶表達(dá)的變化。
　　 結(jié)果:(1)對ATF6蛋白，再灌注后ATF6蛋白表達(dá)平均灰度值明顯下降，表明其蛋白陽性數(shù)明顯增多（P＜0.01），MCAO組大鼠腦缺血再灌注24h缺血半暗帶ATF6表達(dá)達(dá)小低峰（P＜0.01），隨再灌注時(shí)間延長其表達(dá)逐漸升高，但仍保持較低表達(dá)水平(P＜0.01)。BIP組能明顯

5、降低大鼠缺血再灌注損傷后ATF6蛋白表達(dá)平均灰度值水平，即能升高陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)，與MCAO組比較，BIP組大鼠12h至1dATF6蛋白表達(dá)平均灰度值明顯下降(P＜0.05)，清熱化瘀顆粒預(yù)處理組表達(dá)較單純?nèi)毖俟嘧⒔M低(P＜0.01)，與BIP組比較，大鼠1dATF6蛋白表達(dá)平均灰度值明顯降低（P＜0.05），且與腦組織病理形態(tài)學(xué)改變相一致。說明清熱化瘀顆粒預(yù)處理能夠促進(jìn)梗死后ATF6表達(dá)。QRHY組與QKL對照組比較，1d至2dATF

6、6蛋白表達(dá)平均灰度值明顯下降，說明相比清開靈顆粒，清熱化瘀顆粒能夠更好的促進(jìn)梗死后ATF6表達(dá)。
　　 (2)對GADD153蛋白，再灌注1d其平均灰度值降至最低，表明其陽性細(xì)胞表達(dá)達(dá)高峰(P＜0.01)，至再灌注2d其蛋白表達(dá)平均灰度值仍高。BIP組能明顯升高大鼠缺血再灌注損傷后GADD153蛋白表達(dá)平均灰度值水平，即能降低陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)，與MCAO組比較，BIP組大鼠12h至1dGADD153蛋白表達(dá)平均灰度值明顯上升（P＜

7、0.01）。清熱化瘀顆粒預(yù)處理組表達(dá)較單純?nèi)毖俟嘧⒔M低（P＜0.01），與BIP組比較，大鼠1dGADD153蛋白表達(dá)平均灰度值明顯上升（P＜0.05），且與腦組織病理形態(tài)學(xué)改變相一致。說明清熱化瘀顆粒預(yù)處理能夠抑制梗死后GADD153表達(dá)。QRHY組與QKL對照組比較，1d至2dGADD153蛋白表達(dá)平均灰度值明顯上升，說明相比清開靈顆粒，清熱化瘀顆粒能夠更好的抑制梗死后GADD153表達(dá)。
　　 (3)熒光定量PCR結(jié)果顯

8、示，SO組有少量表達(dá);MCAO組大鼠腦缺血再灌注24h缺血半暗帶ATF6mRNA表達(dá)達(dá)高峰(P＜0.01)，隨再灌注時(shí)間延長其表達(dá)逐漸下降，但仍保持較高表達(dá)水平（P＜0.01）;BIP組缺血各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平較MCAO組均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01）;QRHY組和QKL對照組較BIP組各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P＜0.05)。QRHY組較QKL對照組各時(shí)間點(diǎn)其表達(dá)水平進(jìn)一步升高（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:(1)

9、腦缺血再灌注誘發(fā)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，啟動了ATF6介導(dǎo)的UPR信號通路。(2)清熱化瘀顆粒預(yù)處理通過上調(diào)大鼠腦缺血再灌注后ATF6的表達(dá)，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)及隨后的凋亡信號通路，抑制前凋亡因子GADD153蛋白的合成，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用，減輕腦缺血再灌注損傷，可以改善腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺損并減少梗死體積。而在通過影響ERS后ATF6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達(dá)，抑制前凋亡因子GADD153蛋白的合成，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞方