缺血后處理保護腦缺血再灌注損傷的機制研究——減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激.pdf

1、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān)，過強或持續(xù)時間過長的ERS可以引起細胞凋亡。缺血后處理(ischemic postconditioning)是指組織器官發(fā)生缺血后，在長時間的再灌注之前進行數(shù)次反復(fù)、短暫的再灌注/缺血處理，調(diào)動機體內(nèi)源性的保護機制以減輕組織再灌注損傷的處理措施。近年來，缺血后處理的神經(jīng)保護作用已經(jīng)被證實。缺血后處理在缺血后施行，可操作性大，具有很大

2、的實用價值和臨床應(yīng)用前景。目前對缺血后處理機制的研究不多，缺血后處理保護腦缺血再灌注損傷具體機制尚不明確。
　　 本課題擬應(yīng)用大鼠永久性局灶性腦缺血模型，觀察缺血后處理對大鼠腦缺血/再灌注(I/R)損傷的影響，探討缺血后處理腦保護作用是否跟減弱ERS有關(guān)，并進一步研究PI3K-Akt信號通路是否介導(dǎo)這一作用。從而為臨床治療腦缺血/再灌注損傷提供可靠的實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。本課題研究內(nèi)容分為三部分：
　　 1、缺血后處理保護

3、腦缺血再灌注損傷的研究。
　　 2、缺血后處理通過抑制ERS減輕腦缺血再灌注損傷。
　　 3、缺血后處理通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt通路抑制ERS誘導(dǎo)的凋亡。
　　 第一章：缺血后處理保護腦缺血再灌注損傷的研究
　　 目的：建立大鼠永久性局造性腦缺血模型，觀察缺血后處理對大鼠缺血再灌注損傷的腦保護作用。
　　 方法：健康雄性SD大鼠，體重350-450 g。隨機分為三組：假手術(shù)(Sham)組，缺血再灌

4、注(I/R)組，缺血后處理(Postcond)組。電凝法進行左側(cè)大腦中動脈永久性阻斷，缺血再灌注模型為pMCAO+雙側(cè)頸總動脈夾閉30 min。雙側(cè)頸總動脈阻斷30 min后松開，造成腦缺血再灌注，后立即實施缺血后處理即松開雙側(cè)頸總動脈夾30s，后夾閉雙側(cè)頸總動脈10 s，連續(xù)重復(fù)三次此過程。各組在缺血前20min，缺血20 min及再灌注20 min分別記錄PH值、動脈血二氧化碳分壓(PCO2)、動脈血氧分壓(PO2)。缺血再灌注后2

5、4 h，用神經(jīng)評分法測定神經(jīng)行為缺失，2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)法測定大鼠腦梗塞面積。
　　 結(jié)果：各組或同組不同時間點PH值、動脈血二氧化碳分壓(PCO2)、動脈血氧分壓(PO2)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與I/K組相比，再灌注24 h Postcond組能明顯改善大鼠神經(jīng)功能(P<0.05)，明顯減少腦梗塞面積(P<0.05)

6、。
　　 結(jié)論：缺血后處理能明顯減少腦梗塞面積，產(chǎn)生神經(jīng)保護效應(yīng)。
　　 第二章：缺血后處理通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激減輕腦缺血再灌注損傷
　　 目的：建立大鼠永久性局造性腦缺血模型，觀察缺血后處理對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的影響，研究缺血后處理新的腦保護機制。
　　 方法：健康雄性SD大鼠，體重350-450 g。隨機分為三組：假手術(shù)(Sham)組，缺血再灌注(I/R)組，缺血后處理(Postcond)組。電凝法進行左側(cè)

7、大腦中動脈永久性阻斷，缺血再灌注模型為pMCAO+雙側(cè)頸總動脈夾閉30 min。雙側(cè)頸總動脈阻斷30 min后松開，造成腦缺血再灌注，后立即實施缺血后處理即松開雙側(cè)頸總動脈夾30 s，后夾閉雙側(cè)頸總動脈10 s，連續(xù)重復(fù)三次此過程。分別在再灌注6 h、12 h、24 h取大鼠缺血側(cè)半影區(qū)大腦皮層，免疫組化法和Western Blot法檢測缺血側(cè)大腦皮層GRP78、CHOP、caspase-12蛋白表達，原位末端標記(Terminal d

8、eoxynucleotidyl transferase mediatedBiotin-dUTP niek-end labeling，TUNEL)法檢測神經(jīng)細胞凋亡。
　　 結(jié)果：與I/R組比較，再灌注24 h Postcond明顯減少凋亡分子CHOP和caspase-12陽性細胞表達，再灌注12 h和24 h Postcond明顯增加GRP78蛋白陽性細胞表達(P<0.05)。與Sham組比較，再灌注6 h CHOP、caspa

9、se-12、GRP78蛋白表達開始增加，再灌注24 h達高峰(P<0.05)。與I/R組比較，再灌注24 h Postcond明顯減少凋亡分子CHOP、cleaved-caspase-12表達(P<0.05)，再灌注12 h、24 h Postcond明顯增加GRP78蛋白的表達(P<0.05)。Sham組大腦皮層中未見明顯凋亡細胞。I/R組，再灌注6 h神經(jīng)細胞凋亡增加，再灌注12 h凋亡細胞逐漸增加，再灌注24 h達到高峰。與I/R

10、組相比，再灌注24 h Postcond明顯減少神經(jīng)細胞凋亡(P<0.05)。
　　 結(jié)論：腦缺血再灌注損傷誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。缺血后處理下調(diào)凋亡分子CHOP、caspase-12表達，上調(diào)GPR78蛋白表達，抑制ERS誘導(dǎo)的細胞凋亡，減輕腦缺血再灌注損傷。
　　 第三章缺血后處理通過調(diào)節(jié)PI3K-Akt通路抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡
　　 目的：建立大鼠永久性局造性腦缺血模型，觀察PI3K-Akt信號通路在

11、缺血后處理抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細胞凋亡的作用。
　　 方法：健康雄性SD大鼠，體重350-450 g。隨機分為四組：假手術(shù)(Sham)組，缺血再灌注(I/R)組，缺血后處理(Postcond+DMSO)組，缺血后處理+PI3K特異性抑制劑LY294002(Postcond+LY294002)組。電凝法進行左側(cè)大腦中動脈永久性阻斷，缺血再灌注模型為pMCAO+雙側(cè)頸總動脈夾閉30 min。雙側(cè)頸總動脈阻斷30 min后松開，造成腦

12、缺血再灌注，后立即實施缺血后處理即松開雙側(cè)頸總動脈夾30s，后夾閉雙側(cè)頸總動脈10 s，連續(xù)重復(fù)三次此過程。LY294002溶于DMSO，10μl，10 mM，于后處理前15分鐘側(cè)腦室給藥。用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)法測定大鼠腦梗死面積。再灌注24 h取大鼠缺血側(cè)半影區(qū)大腦皮層，免疫組織化法和Western Blot法檢測缺血側(cè)半影區(qū)大腦皮層G

13、RP78、CHOP、caspase-12、P-Akt(Ser473)蛋白表達變化，原位末端標記(Terminal deoxynucleotidyl transferase mediated Biotin-dUTP niek-endlabeling，TUNEL)法檢測神經(jīng)細胞凋亡。
　　 結(jié)果：與I/R組相比，Postcond明顯減輕腦梗塞面積，給予特異性抑制劑LY294002后，部分拮抗Postcond的腦保護作用(P<0.05

14、)。與Sham組比較，I/R組CHOP、caspase-12、GRP78蛋白表達增高(P<0.05)。與I/R組比較，Postcond明顯減低CHOP、caspase-12蛋白表達，明顯增高GRP78、P-Akt蛋白表達。與Postcond+DMSO組比較，預(yù)先給予抑制劑LY294002后，CHOP、caspase-12蛋白表達明顯增高，GRP78、P-Akt蛋白表達明顯減少。Sham組大腦皮質(zhì)未見明顯凋亡細胞。與Sham組比較，I/R

15、組CHOP、caspase-12、GRP78陽性細胞及神經(jīng)凋亡細胞明顯增多(P<0.05)。與FR組相比，Postcond明顯減少CHOP、caspase-12陽性細胞和神經(jīng)凋亡細胞，明顯增加GRP78陽性細胞(P<0.05)。與Postcond+DMSO組相比，預(yù)先給予抑制劑LY294002，CHOP、caspase-12陽性細胞及神經(jīng)凋亡細胞明顯增加，GRP78陽性細胞明顯減少(P<0.05)。
　　 結(jié)論：缺血后處理通過減