原料乳中金黃色葡萄球菌的分離及PCR檢測.pdf

1、食源性疾病是近年來倍受關注的話題之一，對相關的食源性致病菌的檢測研究受到了前所未有的重視，其中細菌性食物中毒又占據了重要地位。金黃色葡萄球菌(金葡菌)是引起食物中毒的主要病源菌之一，同時也是引起奶牛乳房炎及多種臨床化膿性感染的主要病原菌，其快速檢測技術一直是研究熱點。PCR技術自問世以來由于其本身高特異性、靈敏性及操作簡便等常規(guī)方法無法媲美的優(yōu)點而被廣泛應用于包括食品微生物檢測在內的諸多領域。 本實驗首先利用金葡菌的高度耐鹽性及

2、法國梅里埃公司的選擇性培養(yǎng)基(Baird-Parker+兔血漿)自行從乳中分離出金葡菌菌株；對陽性標準株ATCC25923、自行分離金葡菌株，以及大腸桿菌、沙門氏菌等陰性對照菌同時進行PCR擴增，以是否出現(xiàn)279bp條帶為標準驗證nuc基因對金葡菌的特異性，完成了PCR擴增產物的測序并與Genebank中標準序列V01281比對，結果顯示兩者有99％的同源性，進一步確定了擴增片段的特異性；通過比較75％乙醇、丙酮預處理后的擴增效果確定了

3、丙酮處理對金葡菌細胞壁有更好的裂解作用；以影響PCR反應的主要因素：Mg2+濃度、引物濃度、dNTP濃度及Taq酶濃度為對象進行了單因素及多因素正交優(yōu)化實驗，并最終確定了各成分的最佳配比為：Mg2+2ul、引物2ul、dNTP3ul、Taq酶1.5U。在上述實驗條件下確定了檢測靈敏性為1.2×105cfu/ml菌或19.95ngDNA；干擾實驗表明大腸桿菌和沙門氏菌對特異性擴增及靈敏性無明顯影響；培養(yǎng)基增菌檢測實驗表明：初始菌濃度為1.

4、5×104、103、102cfu/ml時PCR方法可分別在培養(yǎng)4h、6h及12h后檢出。 比較了生理鹽水洗滌、PBS緩沖液洗滌和有機試劑處理三種方法對乳中金葡菌DNA提取的不同影響作用，確定了有機試劑處理對排除乳中背景基質的影響作用效果最好；靈敏性實驗表明可檢測出乳中存在的3.2×105cfu/ml金葡菌，或25.4ngDNA，這與培養(yǎng)基中的檢測靈敏性接近；初步比較了不同乳脂含量、乳鈣含量對PCR反應的影響作用，發(fā)現(xiàn)乳脂含量對擴

5、增結果無明顯影響，而乳鈣含量則相對來說有更明顯的影響作用； 對典型的市售食品(羊肉片、豆腐干、肉腸、巴氏乳)進行了增菌檢測實驗，雖然由于各次實驗中初始接菌量及增菌條件略有不同而導致檢測結果出現(xiàn)了一定的差異，但從整體來看，初始菌量為10、102、103cfu/ml時各種食品中均可以在10h內檢測出。 本實驗驗證了nuc基因在金黃色葡萄球菌鑒定實驗中的特異性，通過優(yōu)化反應條件確定了PCR檢測的靈敏性，并完成了幾中常見市售食品