多重PCR檢測沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的研究.pdf

1、食品中污染的病原細菌是引起食源性疾病的主要因素之一，快速檢測食品中病原細菌是及時有效預防病原細菌傳播及食物中毒的重要前提。目前病原細菌的檢測主要依靠常規(guī)的細菌學培養(yǎng)方法，一般需4～7d，操作繁瑣，費時耗力；多重PCR作為一種可同時檢測多種病原細菌的方法發(fā)展十分迅速。本研究建立了沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的多重PCR檢測技術(shù)，并初步應(yīng)用于湖北省出入境檢驗檢疫局部分出口食品樣品的檢測中，主要研究結(jié)果如下： 1 沙門菌、大腸桿

2、菌和金黃色葡萄球菌多重PCR引物設(shè)計及特異性分析 （1）根據(jù)沙門菌invA基因、大腸桿菌phoA基因和金黃色葡萄球菌nuc基因序列，應(yīng)用Primer 5.0設(shè)計引物并通過Oligo 6.0進行分析，確保引物之間無二聚體形成，并對各引物間的互補性、最佳退火溫度進行了分析，同時應(yīng)用BLAST程序，通過GeneBank對各引物及擴增產(chǎn)物進行同源性對比，獲得三對特異性引物。 （2）優(yōu)化沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌PCR反應(yīng)條

3、件，進行了引物特異性實驗，結(jié)果設(shè)計的沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌引物能特異的擴增出284bp、622bp、484bp的目的條帶，對照菌株均為陰性。引物間無交叉反應(yīng)，特異性好。 2　沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌多重PCR檢測方法的建立 經(jīng)過優(yōu)化實驗確定了多重PCR最佳反應(yīng)條件為沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的引物濃度分別為40nmol／L、40nmol／L、80nmol／L，Mg<'2+>濃度2.4mmol／L，

4、dNTP濃度200μmol／L，Taq DNA聚合酶1.5U。循環(huán)參數(shù)為：94℃預變性7min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。在此條件下多重PCR同時檢測沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌DNA的敏感性分別是10.2pg、10.2pg、102pg。 3 同時富集沙門菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌增菌培養(yǎng)基的研究 本研究設(shè)計出一種能同時富集培養(yǎng)沙門菌、大腸桿菌和金

5、黃色葡萄球菌的緩沖鹽水肉湯（buffed saline broth，BSB），其主要組分和含量為：蛋白胨10g、牛肉膏3g、磷酸氫二鈉（Na2HPO<,4>·12H<,2>O）9g、磷酸二氫鉀1.5g、添加劑50g、蒸餾水1000mL，pH7.2。 4　多重PCR檢測方法的應(yīng)用與評價 對10份人為接種病原菌牛奶樣品、20份污水樣品和50份湖北省出入境檢驗檢疫局出口蝦樣品，多重PCR和國標方法均有9份沙門菌陽性，27份大腸