AcrAB-TolC主動(dòng)外排泵與宋內(nèi)志賀菌多重耐藥關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　研究宋內(nèi)志賀菌臨床分離株的耐藥表型，探索宋內(nèi)志賀菌AcrAB-TolC主動(dòng)外排泵基因及其調(diào)控基因與多重耐藥的關(guān)系，闡明細(xì)菌多重耐藥的分子機(jī)制，為指導(dǎo)臨床合理使用抗菌藥物，遏制多重耐藥菌株的產(chǎn)生以及新藥研發(fā)提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、宋內(nèi)志賀菌的收集、鑒定和藥物敏感性分析:收集濟(jì)南市疾病預(yù)防控制中心和濟(jì)南市第四人民醫(yī)院保存的宋內(nèi)志賀菌共41株，通過生化反應(yīng)和血清學(xué)方法對(duì)菌株進(jìn)行鑒定。采用瓊脂紙片擴(kuò)散法

2、和E-test法測(cè)定所有菌株對(duì)7種抗菌藥物（氨芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明）的耐藥性。
　　2、宋內(nèi)志賀菌主動(dòng)外排模型的構(gòu)建以及泵抑制劑的干預(yù):選取兩株宋內(nèi)志賀菌野生株，以環(huán)丙沙星為誘導(dǎo)劑，通過不斷誘導(dǎo)培養(yǎng)使其轉(zhuǎn)變?yōu)槟退幹?，E-test法測(cè)定誘導(dǎo)后菌株對(duì)7種抗菌藥物（氨芐西林、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、慶大霉素、氯霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明）的MIC值，比較誘導(dǎo)前后MIC值的變化。采用常量肉湯稀釋法比較

3、加入主動(dòng)外排泵抑制劑PAβN前后誘導(dǎo)耐藥株對(duì)環(huán)丙沙星的MIC值變化，分析外排泵抑制劑對(duì)耐藥表型的影響。
　　3、AcrAB-TolC主動(dòng)外排泵基因(acrA、acrB和tolC)及泵阻遏基因(acrR、marR)的檢測(cè)以及mRNA的表達(dá):用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增全部試驗(yàn)菌株的acrA、acrB、tolC、acrR和marR基因。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行熒光定量分析，以16sRNA為參照，分析誘導(dǎo)前后泵基因和調(diào)節(jié)基因的基因表達(dá)水平的變化

4、。
　　結(jié)果：
　　1、藥敏結(jié)果:41株宋內(nèi)志賀菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率分別為:氨芐西林(41.5％)，頭孢噻肟(12.2％)，環(huán)丙沙星(0)，慶大霉素(46.3％)，氯霉素(0)，四環(huán)素(85.4％)，復(fù)方新諾明(85.4％)。41株宋內(nèi)志賀菌中有36株耐藥，耐藥率為87.8％(36/41)，其中16株對(duì)超過4種抗菌藥物耐藥，即有39％的宋內(nèi)志賀菌表現(xiàn)為多重耐藥。耐藥模式有6種，以TS最多，占41.5％。5株菌株對(duì)所有抗菌藥物

5、敏感。
　　2、宋內(nèi)志賀菌誘導(dǎo)結(jié)果和加入外排泵抑制劑后耐藥表型的變化:通過69代誘導(dǎo)傳代，誘導(dǎo)菌株對(duì)環(huán)丙沙星的MIC達(dá)64μg/mL，對(duì)其他幾種結(jié)構(gòu)不同的抗菌藥物也產(chǎn)生了不同程度的耐藥，經(jīng)過環(huán)丙沙星的誘導(dǎo)，原來的敏感菌株均逐步轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘀啬退幹辍＜尤胫鲃?dòng)外排泵抑制劑PAβN后，誘導(dǎo)后的多重耐藥菌株對(duì)環(huán)丙沙星的MIC值出現(xiàn)明顯下降，但未達(dá)到誘導(dǎo)前的敏感水平。
　　3、AcrAB-TolC主動(dòng)外排泵基因、泵調(diào)節(jié)基因檢測(cè)及mRNA的

6、表達(dá)情況:所有菌株均擴(kuò)增出大小分別為1194bp，3150bp，1582bp，512bp和426bp的片段，分別為acrA,acrB，tolC，acrR和marR基因擴(kuò)增產(chǎn)物，未發(fā)現(xiàn)基因缺失株。誘導(dǎo)耐藥株的acrR和marR基因表達(dá)水平明顯低于敏感株，acrA、acrB和tolC基因表達(dá)水平明顯高于敏感株。
　　結(jié)論：
　　1、41株宋內(nèi)志賀菌對(duì)氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明的耐藥率均超過了40％，但對(duì)頭孢菌素類和磺

7、胺類敏感性較高，臨床在治療宋內(nèi)志賀菌感染引起的痢疾可選用敏感性較高的藥物。
　　2、AcrAB-tolC主動(dòng)外排模型建立后，經(jīng)過誘導(dǎo)的敏感菌株除了對(duì)誘導(dǎo)劑環(huán)丙沙星產(chǎn)生耐藥外，還對(duì)其他幾種抗菌藥物也產(chǎn)生了耐藥，這幾種藥物與環(huán)丙沙星在結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制上均不相同，且經(jīng)證實(shí)均為主動(dòng)外排泵AcrAB的作用底物。另外，在加入主動(dòng)外排泵能量抑制劑PAβN后，誘導(dǎo)耐藥后的菌株的MIC均有不同程度的降低，這說明主動(dòng)外排系統(tǒng)的激活可能是誘導(dǎo)株多重耐藥性