乙型肝炎病毒pre-S-S基因突變與異常血清學診斷模式的相關性研究.pdf

1、HBV感染是全球性健康問題，我國更是一個HBV高感染地區(qū)。HBV屬嗜肝DNA病毒科，基因組長約3.2kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA，分為A～H8個基因型，各基因型又可分為不同基因亞型。各基因型具有不同的地理分布，亞洲感染者主要感染的是基因型B和C。HBV前S/S(pre-S/S)區(qū)編碼大、中、小3種表面蛋白。盡管HBV是DNA病毒，但它特有的一些特征使它的突變幾率遠遠比別的DNA病毒高。在HBV’感染者體內，突變株往往與野生型病毒一起成為混

2、合病毒群。HBV的基因變異對分子生物學和免疫學分析的敏感性提出了挑戰(zhàn)。pre-S/S基因突變給乙型肝炎的實驗診斷、治療及判斷預后帶來許多臨床問題。診斷HBV感染的免疫學試驗是檢測一系列HBV免疫學標志物。病毒基因的變異所致的一系列病毒表型的改變，使人們對免疫學診斷提出質疑。在我們日常的實驗診斷工作中經常會遇到異常的HBV血清學診斷模式，包括：HBsAg和HBsAb同時存在，乙肝五項中僅HBcAb強陽性，乙肝五項中僅HBeAb強陽性，HB

3、sAg陰性但HBeAg陽性，不同診斷試劑診斷HBsAg結果不一致。這些血清學診斷模式的異?？赡芘cHBV pre-S/S基因突變有關。常用的血清學診斷方法在遇到影響抗原決定簇構象、抗原不表達或分泌缺陷等基因突變時，會出現檢測失敗。pre-S/S基因變異可導致免疫逃避、隱匿性HBV感染，血清學檢測時表現為HBsAg和HBsAb同時存在或HBsAg陰性。許多年來，人們都以病人血清中HBsAg作為HBV感染的特征，HBVpre-S/S基因突變對

4、HBsAg檢測和其他HBV血清學標記物的影響及其相關性需要進一步研究。 HBVpre-s突變和“a”決定簇內部的突變對于免疫逃避和隱匿性感染的影響在不同國家和地區(qū)的研究結論并不相同。通常認為“a”決定簇內部的突變，尤其是G145R突變是免疫逃避的主要突變位點。有關東亞地區(qū)的HBVpreS/S突變數據采集主要來自于日本、中國臺灣地區(qū)、韓國，這提示在中國pre-S和S區(qū)基因突變研究數據不多，本地區(qū)(即中國大陸)preS/S突變發(fā)生位

5、點及preS/S突變與HBV血清學異常檢測模式的關系尚需研究。本研究旨在通過對各種異常HBV血清學檢測模式的標本進行S基因分型和pre-S/S區(qū)突變分析，提供本地區(qū)HBV基因型和突變株流行病學數據，探討pre-S/S基因突變與各種異常血清學診斷模式的關系，分析pre-S/S基因突變對實驗診斷結果的影響和造成免疫逃避和隱匿性HBV感染的各種因素。 本研究收集了臨床五種異常HBV血清學檢測結果的標本，并以具有常見血清學檢測結果的標本

6、作為對照組。采用DNA定量檢測方法篩選HBVDNA陽性的標本。應用病毒核酸提取效率較高的方法提取收集血清的HBVDNA。設計特異性引物，通過PCR擴增得到各模板中HIBVpre-S/S擴增產物，并對擴增產物進行純化。通過PCR產物直接測序或克隆測序的方法得到各標本中HBVpre-S/S基因序列，進而進行S基因分型和pre-S/S區(qū)缺失突變和點突變分析。采用非參數假設檢驗方法-Wilcox ranksum test進行統計學分析，討論pr

7、e-S/S區(qū)突變與各種異常血清學檢測模式的關系。 根據血清學實驗結果和核酸檢測結果，實驗標本可被分為三部分進行分析。 第一部分為HBsAg和HBsAb檢測同時陽性的標本。測序分析發(fā)現這些標本中存在pre-S缺失突變、pre-S2起始密碼子突變和“a’決定簇中少數位點的點突變，其中2例標本出現G145R/A突變。與對照組(HBsAg陽性而HBsAb陰性的標本＞比較發(fā)現pre-S缺失突變與HBsAg和HBsAb同時存在具有一

8、定統計學相關性(P=0.024)，而pre-S2起始密碼子突變和“a”決定簇點突變與這種檢測模式不具有統計學相關性(P=0.571，P=0.408)。pre-S缺失突變主要發(fā)生在pre-S13’端和pre-S25’端，3例標本中pre-S13’端大片段缺失突變株與野生型共同存在。pre-S缺失突變通過影響HBV多個功能位點從而形成體內的免疫逃避，造成HBsAg和HBsAb檢測同時陽性。 第二部分為 HBsAg陰性但HBVDNA陽

9、性的標本，其中包括HBsAg陰性但HBeAg陽性的檢測模式、乙肝五項中僅HBcAb強陽性或僅HBeAb強陽性的檢測模式。僅HBcAb強陽性或僅HBeAb強陽性的檢測模式中發(fā)現HBV隱匿性感染的存在，比率分別為1.6％和3.3％。測序結果統計學分析發(fā)現pre-S缺失突變、pre-S2起始密碼子突變和“a”決定簇中的點突變與HBsAg血清學檢測失敗均有統計學相關性(P=0.033，P=0.033，P=0.033)?！癮”決定簇的點突變中2例

10、標本出現G145R/A突變。突變株存在多重突變和混合感染，但結果分析發(fā)現造成HBsAg漏檢的原因不僅僅是pre-S/S突變，循環(huán)中HBsAg水平低于檢測限也是另外一個重要的漏檢原因。 第三部分為不同診斷試劑診斷HBsAg結果不一致的標本。核酸檢測均為陰性，未發(fā)現pre-S/S基因突變。這一部分標本核酸檢測的陰性結果可能與標本選擇的局限性有關。 本研究結果表明由于HBV在體內長期存在和免疫壓力下，慢性HBV感染者可以通過p

11、re-S/S基因突變導致免疫逃避，形成HBsAg和HBsAb同時陽性的檢測結果，pre-S缺失突變與這種檢測模式具有相關性。文獻報道“a”決定簇點突變與這種模式具有相關性，而在本研究中并未得到相同結論。臨床免疫檢測中HBsAg漏檢的原因可能是由于pre-S/S基因突變引起抗原決定簇構象變化或影響抗原的分泌表達而造成的，本研究表明pre-S缺失突變、pre-S2起始密碼子突變和“a”決定簇中的點突變均與HBsAg漏檢具有相關性，但循環(huán)中H

12、BsAg水平低于檢測限也是另外一個重要的原因。本研究中發(fā)現的“a”決定簇點突變主要在以下位點： I/T126S/N/L、Q129N/R/P/H、D144E/G、G145R/A、G130N、T131N和M133T/I。在異常血清學檢測模式中，pre-S/S突變往往表現為多重變異以及不同突變株或突變株與野生型的混合感染。與報道相比，作為免疫逃避主要突變位點的G145R突變并不常見。關于HBV preS/S基因突變與免疫逃避的關系，目前不同的

13、研究有不同的結論，這可能與不同地域HBV流行株變異有關。換言之，免疫壓力下不同基因型或基因亞型可能產生不同類型的突變。本研究中pre-S缺失突變和pre-S2起始密碼子突變全部發(fā)生在基因型C中。 總之，異常血清學檢測模式往往與HBVpre-S/S基因突變相關，DNA檢測和突變株檢測對于這些標本尤為重要。pre-S/S基因突變可造成HBsAg血清學漏檢，HBV低水平攜帶者的低抗原量造成的漏檢同樣值得注意。HBV隱匿性感染不僅可以造