乙型肝炎病毒S蛋白誘導(dǎo)人精子凋亡及功能異常.pdf

1、【背景與目的】
　　乙型肝炎是一個(gè)危害人類健康的全球性問(wèn)題,它可引起慢性肝病,患者死于肝硬化和肝癌的風(fēng)險(xiǎn)極高。雖然病毒感染可影響男性生育力,但迄今為止,關(guān)于乙肝病毒(HBV)感染對(duì)精子功能的影響及其確切的分子機(jī)制人們知之甚少。本項(xiàng)目研究乙肝病毒S蛋白(HBs)對(duì)人精子中發(fā)生的早期凋亡事件和精子受精能力的影響,目的在于了解凋亡與精子受精能力間的關(guān)系,揭示HBs影響男性生育力的分子機(jī)制。
　　【材料與方法】
　　1.材料<

2、br>　　(1)乙肝病毒S蛋白(hepatitis B virus surface protein,HBs)。
　　(2)健康男性精液標(biāo)本,經(jīng)知情同意后取自健康男性自愿者。
　　(3)廢棄人卵母細(xì)胞,經(jīng)知情同意后取自臨床體外受精術(shù)患者。
　　(4)實(shí)驗(yàn)用試劑與培養(yǎng)基。
　　2.方法
　　人精子經(jīng)0、25、50、100μg/mlHBs處理后,用下列方法檢測(cè)HBs對(duì)人精子凋亡和受精能力的影響。
　　(1)

3、用鈣熒光指示劑染色法(the fluo-4 AM calcium assay)檢測(cè)精子細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)的變化。
　　(2)用鈣黃綠素/鈷離子熒光染色技術(shù)(the Calcein/Co2+assay)檢測(cè)精子線粒體膜通透轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開(kāi)放狀態(tài)。
　　(3)用蛋白分離與ELISA技術(shù)(the protein extraction and ELISA,)分別檢測(cè)人精子線粒體組分和胞漿組分中細(xì)胞色素C(cyt c)的含量

4、。
　　(4)用ADP∕ATP比值測(cè)定技術(shù)(the ADP/ATP ratio assay)檢測(cè)人精子中的ADP/ATP比值。
　　(5)用計(jì)算機(jī)輔助精子分析(computer assisted sperm analysis,CASA)技術(shù)檢測(cè)人精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)。
　　(6)用人精子與卵透明帶體外結(jié)合試驗(yàn)檢測(cè)人精子與卵透明帶結(jié)合的能力。
　　(7)用豌豆凝集素?zé)晒鈽?biāo)記(PSA-FITC)染色技術(shù)檢測(cè)卵透明帶誘發(fā)精子頂

5、體反應(yīng)的能力。
　　【結(jié)果】
　　人精子經(jīng)0、25、50、100μg/mlHBs分別處理3h,各組結(jié)果依次如下。
　　(1)各組平均[Ca2+]i依次為502.32±135.25,748.06±249.27,1171.11±189.12和1673.94±223.02nmol/106sperm;隨HBs濃度增加而上升。HBs50、100μg/ml組的平均[Ca2+]i與對(duì)照組的相比,差異非常顯著(P<0.01)。

6、　　(2)各組鈣黃綠素平均熒光強(qiáng)度(FI)依次為433.59±119.47,356.06±96.87,291.64±80.31和214.66±73.7,隨HBs濃度增加而下降。各實(shí)驗(yàn)組鈣黃綠素的平均熒光強(qiáng)度與對(duì)照組的相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　(3)各組精子線粒體組分中的細(xì)胞色素C(cytc)平均含量依次為124.95±10.47,109.69±9.17,89.58±10.78和74.44±11.16ng/mg

7、,隨HBs濃度增加而下降;精子胞漿組分中的cytc平均含量依次為5.04±1.52,13.01±2.5,27.73±6.75和49.66±8.12ng/mg,隨HBs濃度增加而上升。無(wú)論是線粒體組分還是胞漿組分,對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組間cytc含量的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;P<0.01)。
　　(4)各組ADP/ATP的平均比值依次為0.04±0.02,0.27±0.05,0.48±0.04和0.83±0.05,隨HBs濃度增

8、加而上升。對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組間,ADP/ATP平均比值的差異非常顯著(P<0.01)。
　　(5)各組精子的平均活率(％)依次為85.80±4.04,82.40±3.42,73.40±3.59和65.40±3.09,隨HBs濃度增加而下降。HBs50和100μg/ml組的平均活率與對(duì)照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;P<0.01)。
　　(6)各組精子平均超激活率(%)依次為45.00±11.00,36.00±8.0

9、0,30.00±6.00和19.00±4.00,隨HBs濃度增加而下降。各實(shí)驗(yàn)組精子平均超激活率與對(duì)照相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05;P<0.01)。
　　(7)各組精子平均運(yùn)動(dòng)速度隨HBs濃度增加而下降。
　　(8)各組卵透明帶誘發(fā)的精子頂體反應(yīng)(ZPIAR)平均百分率(%)依次為38.36±8.73,28.57±11.76,18.99±6.84和10.98±3.58,隨HBs濃度增加而下降。各實(shí)驗(yàn)組ZPIAR的平

10、均百分率與對(duì)照組間的差異顯著或非常顯著(P<0.05;P<0.01)。
　　上述各實(shí)驗(yàn)組,HBs的效應(yīng)均具有劑量依賴關(guān)系。
　　HBs處理各組結(jié)合到卵透明帶上的精子數(shù)目與對(duì)照組的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)
　　【結(jié)論】
　　HBs可誘發(fā)人精子細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、MPTP不可逆開(kāi)放、cyt-c從線粒體釋放入胞漿,導(dǎo)致線粒體功能受損,ADP/ATP比值下降,觸發(fā)一系列早期凋亡級(jí)聯(lián)事件;同時(shí)HBs可引起精子活率