甲狀腺激素對內(nèi)皮細胞凋亡的影響及OPG干預(yù)研究.pdf

1、背景: 心血管疾病已成為危害人類健康的第一殺手，動脈粥樣硬化是心血管事件發(fā)病的共同基礎(chǔ)。甲狀腺功能異常可直接或間接導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。血管內(nèi)皮功能障礙是動脈粥樣硬化的早期病理生理改變。血管內(nèi)皮完整性及內(nèi)分泌功能是維持血管內(nèi)皮功能正常的重要基礎(chǔ)，因此血管內(nèi)皮細胞凋亡增加是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要機制。甲狀腺功能異?；颊吆喜⒀軆?nèi)皮功能障礙，是其高于同性別、同年齡正常人群的心血管事件發(fā)生率的重要原因，而早期血管內(nèi)皮功能障礙是可以逆轉(zhuǎn)

2、的，因此早期診斷、早期治療甲狀腺疾病患者血管內(nèi)皮功能障礙顯得十分重要。然而，在甲狀腺功能異常狀態(tài)下動脈粥樣硬化的發(fā)生，尤其是血管內(nèi)皮功能受損的機制目前仍然不清楚。
　　 護骨素（OPG）是一種分泌型糖蛋白，可抑制破骨細胞分化和功能，增高骨密度。近來發(fā)現(xiàn)它是一種重要的血管調(diào)節(jié)因子。甲狀腺功能異?；颊咄檠錙PG水平升高，但是OPG在甲狀腺功能異常狀態(tài)下對血管內(nèi)皮功能的具體的作用及機制目前尚不清楚。
　　 核因子κ B是

3、重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，廣泛參與許多病理生理反應(yīng)。IκB激酶(IKK)是核因子KB激活的關(guān)建酶。IKK由3個亞基組成，IKKα、IKKβ和IKKγ，而IKK活性主要表現(xiàn)為IKKβ。IKKβ能抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)重要的上游蛋白TSC1活性。mTOR作為很多信號通路的下游，在調(diào)節(jié)細胞營養(yǎng)和能量代謝、蛋白質(zhì)合成、細胞生長與凋亡中發(fā)揮重要作用，mTOR主要通過調(diào)節(jié)核糖體S6蛋白激酶(S6K)和真核細胞始動因子4E結(jié)合蛋白1(4EB

4、P1)活性來發(fā)揮作用，而OPG對甲狀腺功能異常狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細胞凋亡及核因子κB，mTOR作用及機制目前缺乏相關(guān)研究證據(jù)。
　　 為此，本課題假設(shè):甲狀腺功能異常狀態(tài)引起血管內(nèi)皮細胞凋亡增加，OPG通過抑制IKKβ/mTOR信號通路，對血管內(nèi)皮細胞具有保護作用。
　　 目的:本研究通過不同濃度甲狀腺激素干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細胞，探討OPG對不同甲狀腺功能狀態(tài)下人臍靜脈內(nèi)皮細胞的作用及其機制，旨在為OPG在未來治療及預(yù)防甲狀

5、腺功能異?；颊哐懿∽兗皠用}粥樣硬化等方面的應(yīng)用研究提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng):入臍靜脈內(nèi)皮細胞株用含10％小牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞常規(guī)在37℃、5％ CO2、100％濕度的培養(yǎng)箱中生長。
　　 2.MTT試驗:MTT法檢測不同濃度甲狀腺激素（0、0.1、1、10、50、100nmol/L，T3）在不同時間(24h、48h、72h)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞活性影響，為后續(xù)實驗探討最佳

6、時間點。
　　 3.細胞凋亡檢測:Hoechst33258與流式細胞檢測不同濃度甲狀腺激素下(0、0.1、1、10、50、100nmol/L，T3)對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡影響，為后續(xù)實驗探討最佳低濃度與高濃度甲狀腺激素。
　　 4.實驗分組:將人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)分組:對照組(0nmol/L，T3)、對照組(0nmol/L，T3)+OPG(100ng/ml)、低濃度組(0.1nmol/L，T3)、低濃度組(0.

7、1nmol/L，T3)+OPG(100ng/ml)、生理濃度組(1nmol/L，T3)、生理濃度組（1nmol/L，T3）+OPG(100ng/ml)、高濃度組(10nmol/L，T3)、高濃度組(10nmol/L，T3)+OPG(100ng/ml)下培養(yǎng)48h。Hoechst33258和流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。
　　 5.Western blot分析各組細胞磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶β(p-IKKβ)、NF-κ B抑制蛋

8、白激酶β(IKKβ)、磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1(p-TSC1)、結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1(TSC1)、磷酸化核糖體蛋白S6激酶(p-S6K)、核糖體蛋白S6激酶(S6K)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)、蛋白激酶B(AKT)、Bcl-2及Bax表達水平。
　　 6.統(tǒng)計分析:所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差（(x)±s）表示，MTT數(shù)值采用析因設(shè)計資料的方差分析。Hoechst33258染色與流式細胞術(shù)

9、檢測結(jié)果比較采用單變量方差分析(One-Way ANOVA)，SNK法;干預(yù)組與未干預(yù)組比較用兩個樣本獨立t檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.細胞形態(tài):倒置相差顯微鏡下，可見部分細胞貼壁，伸出偽足;細胞完全貼壁時，呈圓形、短梭形或扁平多角形，且單層排列;3～4d呈魚貫狀相連;5～6d細胞生長緩慢，達到其生長高峰，處于生長平臺期。
　　 2.細胞生長活性(MTT):不同濃度組間有顯著差異(F

10、=299.27，P=0.000)，其中生理濃度(1nmol/L)下細胞活性均高于其他濃度;不同時間組之間有顯著差異(F=1237.19，P=0.000)，生理濃度（1 nmol/L T3）在不同時間點對HUVEC保護作用最佳。細胞生長活性隨著干預(yù)時間延長而減弱，選取48h作為后續(xù)實驗干預(yù)時間點。
　　 3.細胞凋亡檢測:(1) Hoechst33258染色:生理濃度（1nmol/L）時，細胞凋亡率(13.67％±1.85％)最低

11、，各組細胞凋亡率為48.22％±1.06％（0nmol/L，T3），34.13％±0.85％(0.1 nmol/L,T3),31.32％±2.51％(10 nmol/L,T3),62.74％±3.40％(50 nmol/L，T3)，82.47％±6.37％(100 nmol/L，T3)，各組與生理濃度組相比，細胞凋亡率差異均具有顯著性意義(P＜0.05)。(2) Annexin V-FITC/PI雙染法:0、0.1、10nmol/L組與

12、生理濃度組早期凋亡率分別為28.24％±7.57％，29.92％±6.07％，26.13％±2.28％，8.57％±154％;而總凋亡率為44.90％±6.34％，38.95％±7.78％，31.86％±1.06％，13.52％±1.66％，0、0.1、10nmol/L組與生理濃度組相比，早期凋亡率和總凋亡率差異具有顯著性意義(P＜0.05);而50、100nmol/L組和生理濃度組中晚期凋亡率為59.19％±5.86％，75.45％±

13、7.39％，4.95％±1.26％，總凋亡率為67.04％±5.93％，84.66％±6.40％，13.52％±1.66％，而50、100nmol/L組與生理濃度相比，中晚期凋亡率和總凋亡率差異具有顯著性意義(P＜0.05)。(3) Hoechst33258染色觀察OPG對不同濃度甲狀腺激素下人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化:對照組，低濃度組，生理濃度組，高濃度組細胞凋亡率分另為49.27％±4.80％，36.11％±2.57％，18.

14、43％±4.91％，35.91％±1.86％，OPG干預(yù)后，各組細胞凋亡率分別為24.47％±2.16％，15.97％±0.87％，16.16％±2.33％，24.05％±3.04％，對照組、低濃度組、高濃度組細胞干預(yù)前后細胞凋亡率具有明顯差異，P值分別為0.044，0.040，0.043;生理濃度組OPG干預(yù)前后細胞凋亡率無明顯差異(P=0.59)。(4) Annexin V-FITC/PI雙染法檢測OPG對不同濃度甲狀腺激素下人臍靜

15、脈內(nèi)皮細胞凋亡的影響:對照組，低濃度組，高濃度組早期凋亡率分別為35.33％±2.51％，28.63％±0.68％，27.09％±3.29％，OPG干預(yù)后，各組早期凋亡率分別為19.51％±1.33％，11.05％±4.00％，18.40％±7.67％，各組OPG干預(yù)前后早期凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值分別為0.035，0.048，0.019;對照組，低濃度組，高濃度組總凋亡率分別為47.97％±5.11％，39.79％±0.88％，

16、35.14％±2.58％;OPG干預(yù)后，各組總凋亡率分別為30.68％±1.97％，19.30％±3.63％，24.64％±8.78％，各組OPG干預(yù)前后總凋亡率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P值分別為0.048，0.028，0.045。生理濃度組早期細胞凋亡率和總凋亡率分別為12.80％±2.62％，16.55％±2.36％，經(jīng)OPG干預(yù)后，分別為11.98％±2.71％和17.97％±1.55％，干預(yù)前后早期細胞凋亡率和總凋亡率無明顯差異，P

17、值分別為0.885，0.206。
　　 4.IKKβ/mTOR通路:與生理濃度組相比，對照組、低濃度組和高濃度組p-IKKβ、p-S6K、p-TSC1、Bax表達顯著增高（均p＜0.05），p-AKT、Bcl-2表達顯著降低(均p＜0.05);經(jīng)OPG干預(yù)后，對照組、低濃度組、高濃度組p-IKKβ、p-S6K、p-TSC1、Bax分別低于以上未干預(yù)組(均p＜0.05)，而p-AKT、Bcl-2表達高于未干預(yù)組(均p＜0.05);

18、生理濃度組OPG干預(yù)前后p-IKKβ、p-S6K、p-TSC1、p-AKT、Bcl-2、Bax表達無明顯差異（均P＞0.05）;低濃度組與高濃度組經(jīng)rapamycin或BMS345541干預(yù)后，p-AKT、Bcl-2表達增高（均P＜0.05），Bax表達降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.生理濃度甲狀腺激素對人臍靜脈內(nèi)皮細胞保護作用最大。
　　 2.OPG對低、高濃度甲狀腺激素下人臍靜脈上皮細胞具有保