OATP1B1及CYP2C9基因多態(tài)性對(duì)氟伐他汀轉(zhuǎn)運(yùn)代謝影響的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　氟伐他汀是第一個(gè)全化學(xué)合成的降膽固醇藥物，是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，適用于原發(fā)性高膽固醇及原發(fā)性混合型血脂異常等疾病。CYP2C9為氟伐他汀體內(nèi)代謝的主要亞酶，OATP1B1則是氟伐他汀進(jìn)入肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)體。研究顯示CYP2C9和OATP1B1的遺傳變異均直接影響其生理功能，那么此遺傳變異是否造成氟伐他汀的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)的變化，從而引起氟伐他汀療效和副作用的改變，確實(shí)令人關(guān)注。故有必要圍繞

2、CYP2C9及OATP1B1基因多態(tài)性對(duì)氟伐他汀的代謝轉(zhuǎn)運(yùn)影響展開(kāi)系統(tǒng)研究，為氟伐他汀的合理應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的:
　　本課題擬通過(guò)構(gòu)建野生型及突變型CYP2C9重組酶，研究CYP2C9基因多態(tài)性對(duì)氟伐他汀代謝的影響;同時(shí)通過(guò)構(gòu)建OATP1B1*5、*1a和*15重組質(zhì)粒模型，研究OATP1B1基因多態(tài)性對(duì)氟伐他汀轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。綜合分析CYP2C9及OATP1B1基因多態(tài)性對(duì)氟伐他汀基于轉(zhuǎn)運(yùn)代謝影響可能引起的臨床

3、療效的改變。更好的服務(wù)于臨床個(gè)體化治療。
　　方法:
　　1、摸索和建立氟伐他汀重組酶的生物樣本處理和HPLC檢測(cè)方法。
　　2、建立氟伐他汀在重組酶中的孵育方法。
　　3、氟伐他汀在不同基因型CYP2C9重組酶中體外酶促動(dòng)力學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、CYP2C9*1、CYP2C9*3重組酶組，通過(guò)溫孵時(shí)間、重組酶濃度、底物濃度三個(gè)方面來(lái)考察氟伐他汀在野生型和突變體重組酶的代謝動(dòng)力學(xué)特征。采用建立的HPLC法測(cè)

4、定重組酶體系中氟伐他汀及其代謝產(chǎn)物的量，比較氟伐他汀在CYP2C9野生型與突變體之間的代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，并采用米氏方程比較氟伐他汀在野生型和突變體重組酶的代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)VmaxKm、Clint等。
　　4、建立氟伐他汀HEK293T細(xì)胞的生物樣本處理和LC-MS檢測(cè)方法。
　　5、系統(tǒng)展開(kāi)HEK293T、OATP1B1*5、*1a和*15細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代及MTT試驗(yàn)。
　　6、氟伐他汀在表達(dá)OATP1B1*5、OATP1

5、B1*1a及*15的HEK293T細(xì)胞中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)分中為空白對(duì)照組、OATP1B1*1a、OATP1B1*5與OATP1B1*15質(zhì)粒組，通過(guò)按不同時(shí)間點(diǎn)考察對(duì)攝取過(guò)程的影響;通過(guò)按不同酶濃度點(diǎn)考察對(duì)攝取過(guò)程的影響;通過(guò)每組分別加入系列濃度的氟伐他汀，考察底物濃度對(duì)攝取過(guò)程的影響。采用建立的LC-MS法測(cè)定HEK293T細(xì)胞樣本中氟伐他汀濃度，考察三種不同基因型質(zhì)粒模型中氟伐他汀的攝取動(dòng)力學(xué)過(guò)程及其動(dòng)力學(xué)參數(shù)(Km、Vmax、CLin

6、t值)，分析兩個(gè)突變位點(diǎn)對(duì)氟伐他汀轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　7、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，P＜0.05為具有顯著性差異，P＞0.05為無(wú)顯著性差異，P＜0.01為具有極顯著性差異。
　　結(jié)果:
　　1、建立的HPLC檢測(cè)方法完全能夠符合重組酶樣品的分析測(cè)試的要求，具有高靈敏度。定量下限為0.5uM。
　　2、建立的氟伐他汀在CYP2C9重

7、組酶中的孵育方法以及樣品處理方法完全能夠符合本課題的要求。此方法在多次實(shí)驗(yàn)中成功驗(yàn)證，已穩(wěn)定建立。
　　3、CYP2C9*1酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax及CLint值分別為8.96±0.76 uM、11.2±2.11 pmol/min/pmol、1.25;突變型CYP2C9*3酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax及CLint值分別為1.91±0.32uM、0.81±0.02pmol/min/pmol P450、0.42，通過(guò)比較野生型CY

8、P2C9*1和突變型CYP2C9*3重組酶的酶促動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax及CLint值，統(tǒng)計(jì)分析得出(P＜0.01)，說(shuō)明突變型CYP2C9*3代謝氟伐他汀的活性明顯小于野生型CYP2C9*1。
　　4、成功的建立了氟伐他汀細(xì)胞樣品處理方法及細(xì)胞樣品的LC-MS分析檢測(cè)方法，具有高靈敏度和特異性。定量下限為1.0nmol/L。
　　5、HEK293T、OATP1B1*5及OATP1B1*15細(xì)胞生長(zhǎng)良好，形態(tài)大小均一，邊界輪

9、廓清晰，胞漿透亮，可見(jiàn)細(xì)胞核。通過(guò)MTT試驗(yàn)確定氟托伐他汀在1-150uM范圍內(nèi)對(duì)HEK293T細(xì)胞毒性小。
　　6、OATP1B1*5-HEK293T對(duì)氟伐他汀攝取的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax及CLint分別為12.35±1.32uM、3.27±0.53pmol·min-1·mg-1protein、0.26; OATP1B1*15-HEK293T對(duì)氟伐他汀攝取的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax及CLint分別為18.21±1.72uM、6

10、.88±2.01pmol·min-1·mg-1 protein、0.38; OATP1B1*1a-HEK293T對(duì)氟伐他汀攝取的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km、Vmax及CLint分別為17.46±2.05uM、6.32±1.23 pmol·min-1·mg-1protein、0.36。通過(guò)比較攝取動(dòng)力學(xué)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)OATP1B1*1a與OATP1B1*5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(P＜0.05)，差異非常顯著。結(jié)果表明OATP1B1*5基因?qū)Ψニ〉霓D(zhuǎn)運(yùn)能力明顯低于

11、OATP1B1*1a野生型。
　　結(jié)論:
　　1、研究表明，CYP2C9*3（突變型）代謝氟伐他汀的能力較CYP2C9*1（野生型）明顯減弱，提示CYP2C9的基因多態(tài)性對(duì)氟伐他汀的代謝轉(zhuǎn)化影響顯著;
　　2、研究表明，OATP1B1*5（突變型）對(duì)氟伐他汀的轉(zhuǎn)運(yùn)活性較OATP1B1*1a（野生型）降低，提示OATP1B1的基因多態(tài)性對(duì)氟伐他汀的轉(zhuǎn)運(yùn)功能影響確切;
　　3、實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，CYP2C9*3突變的患者