丹參素對OATP1B1攝取瑞舒伐他汀的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、背景：
　　丹參素（Danshensu，Salvianic acid A)是從丹參中分離出的一種酚性芳香酸類化合物。課題組前期研究結(jié)果表明，丹參素為有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運多肽1B1（Organic anion transporting polypeptide1B1，OATP1B1）或大鼠同源性轉(zhuǎn)運體oatplb2的底物。而瑞舒伐他汀亦是OATP1B1/oatplb2底物，臨床上常將兩藥合用，同為OATP1B1底物的丹參素是否表現(xiàn)出競爭性抑

2、制瑞舒伐他汀的攝取轉(zhuǎn)運，造成作用靶點的藥物濃度下降，從而減弱瑞舒伐他汀的降脂療效呢？臨床療效并非如此，原因何在令人關(guān)注！因此本課題將圍繞丹參素對OATP1B1基因﹑蛋白表達(dá)及其對OATP1B1攝取瑞舒伐他汀的影響展開研究，尤其是關(guān)注兩藥聯(lián)用的后果，為臨床兩藥聯(lián)合應(yīng)用于調(diào)血脂治療提供理論和實驗依據(jù)。
　　目的：
　　建立穩(wěn)定高表達(dá)SLCO1B1 mRNA及OATP1B1的HepG2細(xì)胞模型，在此基礎(chǔ)上，采用RT-PCR、Wes

3、tern-blot等技術(shù)手段研究丹參素對SLCO1B1 mRNA及OATP1B1表達(dá)的影響；利用LC-MS法研究丹參素對OATP1B1攝取瑞舒伐他汀的影響，闡明丹參素對OATP1B1攝取瑞舒伐他汀的影響及其相關(guān)機(jī)制。方法：
　　1.規(guī)范化培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀況，繪制細(xì)胞生長曲線。
　　2.采用MTT法檢測丹參素、利福平、瑞舒伐他汀及四溴酚酞磺酸鈉（BSP）對HepG2細(xì)胞的毒性作用，選取細(xì)胞存活率大于80

4、％的實驗條件進(jìn)行后續(xù)的相關(guān)實驗。
　　3.將不同濃度的OATP1B1誘導(dǎo)劑利福平作用于HepG2細(xì)胞模型48h后，應(yīng)用RT-PCR、Western-blot等技術(shù)手段檢測SLCO1B1 mRNA及OATP1B1表達(dá)水平的變化，評價HepG2細(xì)胞模型SLCO1B1 mRNA及OATP1B1的表達(dá)情況。
　　4.以O(shè)ATP1B1誘導(dǎo)劑利福平為探針平行對照實驗，將不同濃度的丹參素作用于HepG2細(xì)胞模型48h后，應(yīng)用RT-PCR、

5、Western-blot等技術(shù)手段檢測SLCO1B1mRNA及OATP1B1表達(dá)水平的變化，評價丹參素對HepG2細(xì)胞模型SLCO1B1 mRNA及OATP1B1表達(dá)的影響，并比較二者對SLCO1B1 mRNA及OATP1B1誘導(dǎo)作用的強(qiáng)弱。
　　5.丹參素對OATP1B1攝取瑞舒伐他汀的影響
　　①摸索和建立HepG2細(xì)胞樣本中RVS的樣品處理方法及檢測方法。
　?、诳疾旆跤龝r間、藥物濃度對RVS攝取轉(zhuǎn)運的影響，選擇

6、較合適的孵育時間及底物濃度，進(jìn)行后續(xù)瑞舒伐他汀的攝取實驗。
　?、圻x擇較合適的誘導(dǎo)時間考察系列濃度丹參素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞后，考察丹參素對OATP1B1攝取瑞舒伐他汀的影響；并以O(shè)ATP1B1強(qiáng)抑制劑四溴酚酞磺酸鈉（BSP）為探針平行對照實驗，分別求算BSP和丹參素對HepG2細(xì)胞中RVS攝取的抑制參數(shù)IC50，比較丹參素與四溴酚酞磺酸鈉（BSP）對OATP1B1攝取瑞舒伐他汀抑制作用的強(qiáng)弱。
　　結(jié)果：
　　1.與空

7、白組相比，10～100μM OATP1B1誘導(dǎo)劑利福平作用于HepG2細(xì)胞48h后，10μM、25μM、50μM﹑100μM利福平分別使SLCO1B1 mRNA的表達(dá)上調(diào)了58.7%、82.6%、97.8%﹑130.4%；OATP1B1的表達(dá)上調(diào)了44.4%、57.4%、90.7%﹑131.5%；10~100μM利福平能明顯上調(diào)SLCO1B1 mRNA和OATP1B1的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在10~100μM濃度范圍

8、內(nèi)，利福平對SLCO1B1 mRNA和OATP1B1表達(dá)的誘導(dǎo)作用均隨濃度的增加而增強(qiáng)（R2=0.7947；R2=0.9187）。
　　2.與空白組相比，20～120μM丹參素作用于HepG2細(xì)胞48h后，20μM、40μM、80μM﹑120μM丹參素分別使SLCO1B1 mRNA的表達(dá)上調(diào)了20.5%、30.7%、42.0%﹑45.5%；OATP1B1的表達(dá)上調(diào)15.2%、55.7%、84.9%﹑89.9%；20～120μM丹參

9、素能明顯上調(diào)SLCO1B1 mRNA和OATP1B1的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在20~120μM濃度范圍內(nèi)，丹參素對SLCO1B1 mRNA和OATP1B1表達(dá)的誘導(dǎo)作用均隨濃度的增加而增強(qiáng)（R2=0.8409；R2=0.8296）。其誘導(dǎo)OATP1B1表達(dá)的誘導(dǎo)參數(shù)EC50=39.0μM，平行實驗組OATP1B1誘導(dǎo)劑利福平誘導(dǎo)參數(shù)EC50=10.3μM。
　　3.丹參素誘導(dǎo)OATP1B1表達(dá)不同時間（0~48

10、h)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)時間為12h，24h時，RVS的攝取量減少22.02%，12.20%；誘導(dǎo)時間為36h，48h時，RVS的攝取量卻增加1.83%，85.39%。以0~120μM丹參素誘導(dǎo)OATP1B1表達(dá)48h后，再以58.55μM丹參素作為底物，以30μM RVS進(jìn)行攝取實驗，與空白組相比，10μM、20μM丹參素使RVS的攝取量減少6.89%，22.10%；40μM、80μM、120μM丹參素使RVS的攝取量增加1.23%﹑79.93

11、%﹑87.64%。
　　4.以O(shè)ATP1B1強(qiáng)抑制劑四溴酚酞磺酸鈉（BSP）為探針平行對照實驗，結(jié)果顯示，BSP抑制瑞舒伐他汀攝取的抑制參數(shù)IC50=17.92μM，而丹參素的抑制參數(shù)IC50=58.55μM。丹參素抑制HepG2細(xì)胞攝取瑞舒伐他汀的能力弱于BSP。結(jié)論：
　　1.丹參素能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞SLCO1B1 mRNA及OATP1B1的表達(dá)，并且能夠增加OATP1B1的轉(zhuǎn)運攝取能力。
　　2.當(dāng)?shù)⑺卣T導(dǎo)O