趨化因子Fractalkine在動脈粥樣硬化過程中的作用機(jī)制及辛伐他汀干預(yù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、Fractalkine(FKN)是一具有粘附活性的趨化因子。膜結(jié)合型FKN獨(dú)特的粘蛋白樣桿狀結(jié)構(gòu)凸出細(xì)胞膜表面，使其易粘附流動的白細(xì)胞。并且，F(xiàn)KN介導(dǎo)的粘附反應(yīng)不需要選擇素(selectin)和整合素(integrin)等其他黏附分子的參與。FKN蛋白跨膜區(qū)N端有一段特殊的保守部位，即由Thr-Arg-Arg-Gln組成的二元斷裂位點(diǎn)(dibasiccleavage site)，在此斷裂位點(diǎn)被蛋白水解酶水解脫落，形成可溶FKN，發(fā)揮趨

2、化效應(yīng)。FKN獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和功能使其廣泛參與炎癥反應(yīng)。慢性炎癥反應(yīng)是動脈粥樣硬化( atherosclerosis，AS)的重要重要機(jī)制之一，白細(xì)胞越過血管向炎癥部位移行是炎癥反應(yīng)中重要的生物學(xué)現(xiàn)象。單核細(xì)胞是AS中泡沫細(xì)胞的前體細(xì)胞，在向炎癥部位遷移的過程中需要趨化因子和黏附分子的參與。近年來的研究資料表明，F(xiàn)KN參與了AS的發(fā)生發(fā)展。 白細(xì)胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)是重要的炎癥因子，是動脈粥樣硬化

3、明確的危險因素。其在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病的發(fā)生、發(fā)展及粥樣斑塊破裂等過程中發(fā)揮重要作用。以往的研究多認(rèn)為，IL-18與AS的密切關(guān)系主要是通過干擾素-y(interferon-γ，IFN-γ)實(shí)現(xiàn)的。而且，在IFN-γ缺失的情況下，IL-18的相關(guān)功能則無法體現(xiàn)。但近期的研究表明，在沒有IFN-γ的參與下，IL-18也可以參與AS的炎癥過程。IL-18與IL-18R結(jié)合導(dǎo)致多種與動脈粥樣硬化相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-6、IL-8、細(xì)胞黏

4、附分子-1和多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)分泌增加。然而，IL-18能否誘導(dǎo)和上調(diào)FKN的表達(dá)，并通過FKN的趨化和粘附功能參與炎癥反應(yīng)，及其機(jī)制尚不清楚。 辛伐他汀(Simvastatine，Sim)是由土曲霉菌降解產(chǎn)物合成的三羥基三甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，廣泛用于冠心病的預(yù)防和治療。除降脂外，還具有改善內(nèi)皮功能，改善心肌缺血，抗炎、抗血栓，穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊等作用。Sim能否通過影響FKN的表達(dá)而發(fā)揮抗炎、穩(wěn)定斑塊的

5、作用尚不明確。 目的: (1)應(yīng)用IL-18作為刺激因素，探討IL-18能否誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)上調(diào)表達(dá)FKN，明確兩者的作用關(guān)系及信號通路； (2)應(yīng)用Transwell進(jìn)行體外趨化試驗(yàn)，觀察FKN對巨噬細(xì)胞源性單核細(xì)胞株( THP-1)的趨化作用； (3)應(yīng)用Flow chamber模擬人體生理血流環(huán)境，觀察FKN介導(dǎo)的HUVECs和THP-1細(xì)胞的粘附； (4)探討辛伐他汀對FK

6、N表達(dá)的影響，以及對FKN趨化和粘附作用的干預(yù)效應(yīng)。 方法: (1) HUVECs與100 ug/L的IL-18孵育0、1、6、12、24小時，半定量RT-PCR方法檢測FKN的mRNA表達(dá)； (2) HUVECs分別與濃度為Oug/L、25 ug/L、50 ug/L、100 ug/L的IL-18共孵育24小時，半定量RT-PCR方法檢測FKN的mRNA表達(dá)： (3)預(yù)先用10umol/L、30umol/

7、L的PDTC預(yù)處理HUVECs，再用100ug/L的IL-18刺激24小時，半定量RT-PCR方法檢測FKN的mRNA表達(dá)； (4)預(yù)先用1umol/ml、10umol/ml、100umol/ml的辛伐他汀預(yù)處理HUVECs，再用100ng/L的IL-18刺激24小時，半定量RT-PCR方法檢測細(xì)胞FKN的mRNA表達(dá)； (5)HUVECs與 Oug/L、25 ug/L.50 ug/L.100 ug/L的IL-18孵育2

8、4小時；10umol/L、30umol/L的PDTC預(yù)處理HUVECs，再用100ug/L的IL-18刺激24小時；預(yù)先用10umol/ml、100umol/ml的辛伐他汀預(yù)處理HUVECs，再用lOOng/L的IL-18刺激24小時；100 ug/L的IL-18刺激HUVECs24小時后，用1umg/L、5ug/L的FKN中和抗體作用3小時。應(yīng)用Transwell裝置觀察FKN對THP-1細(xì)胞的趨化效應(yīng)； (6) HUVECs

9、與0ug/L、25 ug/L、50 ug/L、100 ug/L的IL-18孵育24小時；10umol/L、30umol/L的PDTC預(yù)處理HUVECs，再用100ug/L的IL-18刺激24小時；預(yù)先用10umol/ml、100umol/ml的辛伐他汀預(yù)處理HUVECs，再用100ng/L的IL-18刺激24小時；100 ug/L的IL-18刺激HUVECs24小時后，用1umg/L、5ug/L的FKN中和抗體作用3小時。應(yīng)用Flow

10、chamber裝置觀察FKN在模擬生理血流環(huán)境下介導(dǎo)的HUVEC與THP-1細(xì)胞的粘附。 結(jié)果: (1) HUVECs與100ug/L的IL-18孵育1小時后，F(xiàn)KN表達(dá)無明顯增加，與空白對照組相比p>0.05；HUVECs與100ug/L的IL-18孵育6、12、24小時后，F(xiàn)KN的基因表達(dá)明顯增加，與空白對照組比較p<0.01； (2) HUVECs與Sug/L的IL-18孵育24小時后，F(xiàn)KN表達(dá)量無明顯增

11、加，與空白對照組相比p>0.05；HUVECs與25 ug/L、50 ug/L、100 ug/L的IL-18孵育24小時后，F(xiàn)KN的基因表達(dá)明顯增加，與空白對照組比較p<0.01； (3)用10umol/L、30umol/L的PDTC預(yù)處理HUVEC后，再加入100ug/L的IL-18孵育24小時，F(xiàn)KN表達(dá)量明顯減少，與未經(jīng)PDTC處理的單純100ug/L IL-18刺激組比較p<0.01; (4)用1umol/L的辛

12、伐他汀預(yù)處理HUVECs后，再加入100ug/L的IL-18孵育24小時，F(xiàn)KN表達(dá)量無明顯變化，與單純100ug/L IL-18刺激組比較p>0.05;用10umol/L、100umol/L辛伐他汀預(yù)處理HUVEC后，再加入100ug/L的IL-18孵育24小時，F(xiàn)KN表達(dá)量明顯減少，與未經(jīng)辛伐他汀處理的單純100ug/L IL-18刺激組比較p<0.01。 (5)成功使用Tranwell裝置進(jìn)行了體外趨化試驗(yàn)；FKN能夠趨化

13、靜息的THP-1細(xì)胞； (6)不同濃度IL-18上調(diào)FKN表達(dá)后，對THP-1細(xì)胞的趨化效應(yīng)明顯增強(qiáng)，與對照組比較p<0.01；PDTC、辛伐他汀預(yù)處理HUVEC后，該趨化效應(yīng)明顯減弱，與單純IL-18刺激組相比p<0.01；FKN中和抗體能夠抑制FKN介導(dǎo)的趨化作用，與單純IL-18刺激組相比p<0.01。 (7)成功應(yīng)用Flow chamber在體外模擬了人體生理狀態(tài)的血液循環(huán)條件進(jìn)行粘附實(shí)驗(yàn)；使用EDTA阻斷其他黏

14、附分子的參與后，F(xiàn)KN以非鈣離子依賴的方式介導(dǎo)了HUVECs與單核細(xì)胞THP-1的粘附； (8)不同濃度IL-18上調(diào)FKN表達(dá)后，THP-1細(xì)胞與HUVEC的粘附明顯增加，與對照組比較p<0.01；PDTC預(yù)處理HUVEC后，該粘附效應(yīng)明顯減弱，與單純IL-18刺激組相比p<0.01。FKN中和抗體能夠抑制FKN介導(dǎo)的粘附作用，與單純IL-18刺激組相比p<0.01。10umol/ml的辛伐他汀預(yù)處理HUVEC后，未能明顯抑制

15、FKN介導(dǎo)的粘附反應(yīng)，與單純IL-18刺激組相比p>0.05。100umol/ml的辛伐他汀能夠明顯抑制該粘附效應(yīng)，與單純IL-18刺激組相比p<0.01。 結(jié)論: (1) IL-18能夠呈濃度、時間依賴性上調(diào)FKN的基因表達(dá)。這種誘導(dǎo)作用與NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)； (2)FKN能夠趨化靜息THP-1細(xì)胞，IL-18能夠增加THP-1細(xì)胞的遷移； (3)在模擬生理血液循環(huán)的條件下，F(xiàn)KN能夠介導(dǎo)HUV