Fractalkine在動脈粥樣硬化發(fā)生中的作用及阿司匹林干預(yù)的實驗研究.pdf

1、目的：探討阿司匹林干預(yù)對腫瘤壞死因子α(TNFα)刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUWEC)表達(dá)fractalkine(FKN或CX3CL1)的影響及其機(jī)制。 方法：將生長良好的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分成以下8組(n=3)：①空白組：HUVEC；②TNFα刺激組：HUVEC+TNFα；③NS-398干預(yù)組：HUVEC+NS-398(0.5μmol/L)+TNFα；④)PDTC干預(yù)組：HUVEC+PDTC(40μmol/L)+TNFα；⑤

2、⑥⑦⑧均為阿司匹林干預(yù)組，將分別予0.02mmol/L，0.2 mmol/L，1mmol/L和5mmol/L阿司匹林進(jìn)行干預(yù)。除空白組和TNFα刺激組，其它6組HUVEC分別加入含上述濃度干預(yù)藥物的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，換液，空白組加入RPMI1640培養(yǎng)基，其它7組加入含4ng/mlTNFα的培養(yǎng)基再培養(yǎng)24小時。然后提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測各組細(xì)胞的FKN、環(huán)氧合酶(COX)-1

3、、COX-2和核因子kappaB(NF-kappaB)p65mRNA表達(dá)；提取細(xì)胞膜蛋白、漿蛋白和核蛋白，采用蛋白印跡法檢測各組細(xì)胞的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65蛋白表達(dá)。單因素方差分析各組HUVEC表達(dá)的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65 mRNA相對灰度值以及FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65的蛋白相對灰度值。 結(jié)果： 1.RT-PCR顯示

4、各組HUVEC表達(dá)的FKN、COX-1、COX-2和NF-kappaB p65電泳條帶有強度區(qū)別。單因素方差分析顯示： ①各組HUVEC表達(dá)的FKNmRNA差異有非常顯著性意義。與空白組比較，4ng/mlTNFα使HUVEC的FKNmRNA明顯增加。與TNFα刺激組比較，0.02mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L濃度阿司匹林干預(yù)組HUVEC的FKNmRNA水平下降，并且呈濃度依賴性。與TNFα刺激組

5、比較，40μmol/L PDTC干預(yù)使HUVEC的FKNmRNA水平明顯下降，0.5μmol/L NS-398干預(yù)對FKNmRNA表達(dá)沒有影響。 ②各組HUVEC表達(dá)的COX-1mRNA差異有非常顯著性意義。4ng/mlTNFα刺激后HUVEC的COX-1 mRNA表達(dá)無明顯變化，但是，與TNFα刺激組比較，0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L濃度的阿司匹林使HUVEC的COX-1mRNA水平表達(dá)下降，且呈濃度依賴

6、性。0.02mmol/L阿司匹林、40μmol/L PDTC和0.5μmol/LNS-398干預(yù)對COX-1mRNA表達(dá)沒有影響。 ③各組HUVEC表達(dá)的COX-2mRNA差異有非常顯著性意義。與空白組比較，4ng/ml TNFα使HUVEC的COX-2 mRNA明顯增加。與TNFα刺激組比較，0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L濃度的阿司匹林干預(yù)均使TNFα,誘導(dǎo)的COX-2mRNA水平下降，并且呈濃度依賴性。0

7、.02mmol/L阿司匹林、40μmol/L PDTC干預(yù)對TNFα刺激的COX-2mRNA表達(dá)沒有影響，而0.5μmol/LNS-398干預(yù)抑制TNFα刺激的COX-2mRNA表達(dá)。 ④各組HUVEC表達(dá)的NF-kappaB p65 mRNA差異有非常顯著性意義?？瞻捉M與4ng/ml TNFα刺激組的NF-kappaB p65 mRNA表達(dá)沒有差異，0.02mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L濃度的

8、阿司匹林干預(yù)均使HUVEC的NF-kappaB p65 mRNA水平下降，40μmol/L PDTC干預(yù)抑制NF-kappaB p65 mRNA表達(dá)，而0.5μmol/L NS-398干預(yù)對NF-kappaB p65 mRNA表達(dá)沒有影響。 2.Western blot顯示各組HUVEC表達(dá)的FKN、COX-2和NF-kappaB p65蛋白有強度區(qū)別。單因素分析顯示： ①各組HUVEC表達(dá)的FKN蛋白差異有非常顯著性意

9、義。與空白組比較，4ng/ml TNFα使HUVEC的FKN明顯增加。與TNFα刺激組比較，0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L濃度的阿司匹林干預(yù)均使TNFα誘導(dǎo)的FKN蛋白水平下降，并且呈濃度依賴性。0.02mmol/L阿司匹林、0.5μmol/L NS-398干預(yù)對HUVEC的FKN蛋白表達(dá)沒有影響。40μmol/L PDTC干預(yù)使HUVEC的FKN蛋白水平明顯下降。 ②各組HUVEC表達(dá)的COX-1蛋白差異沒

10、有顯著性意義。 ③各組HUVEC表達(dá)的COX-2蛋白差異有非常顯著性意義。與空白組比較，4ng/ml TNFα使HUVEC的COX-2蛋白表達(dá)明顯增加。與TNFα刺激組比較，0.02mmol/L、0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L濃度的阿司匹林干預(yù)使TNFα誘導(dǎo)的HUVEC的COX-2蛋白表達(dá)下降，并且呈濃度依賴性。0.5μmol/L NS-398和40μmol/LPDTC干預(yù)使COX-2蛋白表達(dá)明顯下降。

11、 ④各組HUVEC表達(dá)的NF-kappaB p65蛋白差異有非常顯著性意義?？瞻捉M與4ng/ml TNFα刺激組的NF-kappaBp65蛋白表達(dá)沒有差異，0.2mmol/L、1mmol/L、5mmol/L濃度的阿司匹林干預(yù)均使HUVEC的NF-kappaBp65蛋白水平下降，40μmol/L PDTC干預(yù)抑制NF-kappaBp65蛋白表達(dá)，而0.02mmol/L、0.5μmol/L NS-398干預(yù)對NF-kappaB p65蛋白

12、表達(dá)沒有影響。 結(jié)論： ①TNFα(4ng/ml)通過活化NF-kappaBp65誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞FKN mRNA以及蛋白表達(dá)增加。 ②阿司匹林濃度依賴性地抑制TNFα誘導(dǎo)的FKNmRNA和蛋白表達(dá)，這一效應(yīng)可能與阿司匹林抑制COX-1活性、NF-kappaBp65活化以及NF-kappaBp65表達(dá)有關(guān)。 ③TNFα(4ng/ml)通過活化NF-kappaBp65誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞COX-2mRN