連接蛋白在動(dòng)脈粥樣硬化過程中的表達(dá)研究.pdf

1、研究目的：
　　利用載脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因敲除小鼠,予以高脂飼料喂養(yǎng),構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)模型。探討在AS形成過程中,縫隙連接蛋白37(connexin 37,cx37)、縫隙連接蛋白40(connexin 40,cx40)和縫隙連接蛋白43(connexin 43,cx43)表達(dá)的改變情況。
　　研究內(nèi)容和方法：
　　1、構(gòu)建小鼠AS模型

2、>　　40只4周齡體重在18-22g雄性SPF級(jí)C57BL/6J載脂蛋白E基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)組(AS組),40只相同周齡及體重范圍的雄性SPF級(jí)C57BL/6J小鼠為對(duì)照組(control組)。兩組小鼠正常飼料喂養(yǎng)至8周齡時(shí),將飼料更換為高脂配方(1％膽固醇+15%豬油)。
　　分別在在高脂飼料喂養(yǎng)0、4、8、12周后,收集實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。小鼠麻醉后,摘除眼球取血,分離血漿行血脂四項(xiàng)檢查,分離PBMC并提取蛋白后凍存。用含肝素的冷PBS

3、灌注沖洗左側(cè)心腔及動(dòng)脈腔內(nèi)的殘血后,換用冷多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注,充分固定后,在解剖顯微鏡下小心剝離血管外周脂肪組織。
　　小鼠血管大體標(biāo)本行蘇丹IV染色以觀察內(nèi)膜脂紋形成情況。分別將分離出的主動(dòng)脈升段、主動(dòng)脈弓、胸主動(dòng)脈行石蠟切片,HE染色鏡下觀察血管形態(tài)判斷ApoE基因敲除小鼠AS模型是否構(gòu)建成功。
　　2、觀測AS病程中,動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞層的改變
　　將分離得到的小鼠胸主動(dòng)脈段血管用戊二醛固定,然后行掃描電子顯微鏡

4、觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞在正常血管和AS病變處的形態(tài)學(xué)改變;用激光共聚焦顯微鏡檢測血管內(nèi)皮細(xì)胞間縫隙連接蛋白所發(fā)出的的熒光信號(hào)。觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞及其間隙連接蛋白在AS病程中的改變情況。
　　3、檢測AS病變處,CXs表達(dá)定位的改變情況
　　主動(dòng)脈段蠟塊切片后,應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測血管壁AS斑塊病變處,cx37、cx40、cx43的表達(dá)。探討AS斑塊內(nèi)CXs表達(dá)的改變情況。
　　4、檢測AS病程中,血管壁CXs表達(dá)的改變情況

5、r>　　小鼠胸主動(dòng)脈血管的蠟塊,切片后,應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測非AS斑塊病變處血管壁cx37、cx40、cx43的表達(dá)。
　　5、外周血單個(gè)核細(xì)胞縫隙連接蛋白CXs的表達(dá)
　　將收集到的PBMC蛋白行蛋白免疫印跡法檢測,以觀察外周血單個(gè)核細(xì)胞cx37、cx40、cx43的表達(dá)。探討AS外周血單個(gè)核細(xì)胞是否存在CXs表達(dá)的改變。
　　研究結(jié)果：
　　1、小鼠AS模型的評(píng)價(jià)
　　1.1、體重變化:高脂飼養(yǎng)前后,A

6、S組和control組小鼠體重在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)無差異。(P>0.05)。
　　1.2、血脂變化:AS組小鼠的TC和LDL較control組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均明顯升高(P<0.01)。TG和HDL在兩組動(dòng)物間無差異。
　　1.3、蘇丹IV染色:AS組主動(dòng)脈內(nèi)膜斑塊狀隆起處被染成猩紅色,無斑塊處呈現(xiàn)內(nèi)膜本色,紅白分明;control組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑,無著色呈現(xiàn)內(nèi)膜本色。表明AS組小鼠血管大體標(biāo)本上出現(xiàn)明顯的AS斑塊。AS病變最先出現(xiàn)在

7、主動(dòng)脈根部,其次為主動(dòng)脈弓部和動(dòng)脈分叉處,隨后在胸主動(dòng)脈段也可觀察到AS病變。
　　1.4、HE染色:AS組主動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增厚,可見脂質(zhì)斑塊形成,斑塊內(nèi)有大量脂肪細(xì)胞,泡沫細(xì)胞,管腔明顯狹窄;control組主動(dòng)脈內(nèi)膜光滑、完整、無增厚,內(nèi)皮下無脂質(zhì)沉積。
　　綜上結(jié)果:顯示該模型指標(biāo)符合動(dòng)脈粥樣硬化的表現(xiàn),AS模型構(gòu)建成功。
　　2、血管內(nèi)皮細(xì)胞層在AS病變過程中的改變
　　掃描電子顯微鏡顯示:正常小鼠胸主動(dòng)脈

8、血管內(nèi)皮細(xì)胞較扁平,大多呈梭形,其間夾雜有少許呈條索狀,其長軸均與血流方向一致。AS小鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞,可觀察到明顯的增生腫脹,呈灶性病變,繼而內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生融合,形成條束狀或小團(tuán)塊;主動(dòng)脈內(nèi)膜表面的小斑塊可逐漸增大、變厚、相互融合成較大的斑塊。
　　激光共聚焦顯微鏡檢測示:小鼠胸主動(dòng)脈血管內(nèi)膜上,cx37和cx40在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá),當(dāng)其表達(dá)量較高時(shí),可通過cx37和(或)cx40的點(diǎn)狀熒光信號(hào)輕易的識(shí)別出每個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞的完整輪廓。co

9、ntrol組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的cx37和cx40表達(dá)量較AS組高。本次試驗(yàn)無法檢測到cx43在小鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞層上的表達(dá)。
　　3、AS斑塊病變內(nèi)CXs的表達(dá)
　　免疫組織化學(xué)檢測示:CD31在血管腔面和斑塊表面呈線性表達(dá),表明AS斑塊病變處擁有完整的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋。cx37可在斑塊表面的內(nèi)皮細(xì)胞,脂質(zhì)核的巨噬細(xì)胞和斑塊底部廣泛表達(dá),cx43也可在斑塊表面的內(nèi)皮細(xì)胞,斑塊底部的平滑肌細(xì)胞上有一定程度的表達(dá)。
　　4、

10、AS病程中,血管壁CXs的表達(dá)(免疫組織化學(xué)檢測)
　　cx37在血管壁的表達(dá),AS組與control組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。AS組小鼠血管壁SMC層的cx37表達(dá)呈上升趨勢,在第4～8周升高較明顯(卡方檢驗(yàn):F=13.946,P<0.05;組間兩兩比較,0周、4周vs8周、12周的P<0.05)。control組小鼠血管壁SMC層的cx37的表達(dá)也呈上升趨勢,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(秩和檢驗(yàn):P>0.0

11、5)。
　　cx40在兩組動(dòng)物不同時(shí)間點(diǎn)的比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05;卡方檢驗(yàn):AS組F=3.051,P>0.05;control組F=3.343,P>0.05;兩兩組間對(duì)比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。
　　cx43在兩組動(dòng)物呈低表達(dá)或無表達(dá)。
　　5、AS外周血單個(gè)核細(xì)胞CXs的表達(dá)(蛋白免疫印跡技術(shù))
　　cx37在PBMC的表達(dá),在整個(gè)飼養(yǎng)周期的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,AS組均明顯低于control組(P<0.01

12、)。AS組小鼠PBMC的cx37表達(dá)呈下降趨勢(F=84.913,P<0.05);control組小鼠PBMC的cx37表達(dá)較穩(wěn)定(F=0.901,P>0.05)。
　　cx40在PBMC的表達(dá),在整個(gè)飼養(yǎng)周期的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,AS組均明顯低于control組(P<0.05),但兩組小鼠PBMC的cx40表達(dá)在整個(gè)飼養(yǎng)周期中均無明顯變化(卡方檢驗(yàn):AS組F=2.672,P>0.05;control組F=2.68,P>0.05。)

13、r>　　cx43在兩組動(dòng)物PBMC的表達(dá),在整個(gè)飼養(yǎng)周期的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上,均無明顯變化,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(卡方檢驗(yàn):AS組F=2.55,P>0.05;control組F=3.858,P>0.05。)
　　結(jié)論：
　　1、cx37在血管壁全層、AS斑塊內(nèi)部和PBMC廣泛表達(dá),且在不同時(shí)期存在改變,因此,cx37在AS病程中的作用應(yīng)當(dāng)引起更多的重視。
　　2、cx40雖然也同時(shí)在血管壁和PBMC表達(dá),但其表達(dá)量較小,也未