LIMK1-cofilin信號通路調(diào)控BDNF誘導的軸突生長和厭惡性記憶消退的機制研究.pdf

1、背景:
　　 肌動蛋白(Actin)是一種細胞骨架蛋白，它在細胞生理功能方面發(fā)揮了重要的作用，包括胞漿分裂、內(nèi)吞、神經(jīng)生長等。肌動蛋白發(fā)揮它的生物學功能主要是通過肌動蛋白重組(Actin remodeling)，即單體肌動蛋白(G-actin)和絲狀肌動蛋白(F-actin)之間的動態(tài)變化。肌動蛋白重組受多種蛋白的調(diào)控，例如ADF/cofilin、Arp2/3、Eps8、Profilin、myosinⅡ、myosinⅤ。由于AD

2、F/cofilin廣泛分布于所有的真核細胞，并且對肌動蛋白重組具有最直接的調(diào)控功能，且對發(fā)育具有重要的作用，逐漸成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移、生殖系統(tǒng)疾病、循環(huán)系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等的研究熱點。
　　 神經(jīng)細胞發(fā)揮正常的生理功能依賴于神經(jīng)細胞正常的生長發(fā)育及分化。在神經(jīng)元極性分化的過程中，軸突的生長早于樹突，軸突末端的膨大稱為生長錐(Growth cone)，由絲狀偽足(Filopodia)和板狀偽足（Lamellipodia）構(gòu)成，它們

3、的動態(tài)變化指引了軸突生長的方向。在軸突生長錐的胞膜附近富含肌動蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，肌動蛋白動態(tài)變化是軸突生長的基礎。神經(jīng)營養(yǎng)因子尤其是目前研究最多的BDNF對神經(jīng)元的生長、分化、存活及突觸可塑性方面具有非常重要的作用。盡管如此，BDNF如何調(diào)控肌動蛋白重組促進神經(jīng)元生長發(fā)育的具體機制有待進一步研究。
　　 在成年哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元絕大多數(shù)以化學性突觸的形式互聯(lián)，形成神經(jīng)元網(wǎng)絡?；瘜W性突觸大多是由突觸前神經(jīng)元的軸突末梢和突觸后神

4、經(jīng)元的樹突棘及兩者之間的突觸間隙組成。這種突觸具有可塑性，表現(xiàn)為突觸前膜釋放神經(jīng)遞質(zhì)具有可調(diào)控性，突觸后膜的形態(tài)及受體數(shù)目具有可變性。肌動蛋白網(wǎng)絡作為細胞骨架成分之一是維持突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)基礎，肌動蛋白細胞骨架的解聚和聚合與突觸后膜AMPA受體內(nèi)吞和上膜也有密切的聯(lián)系。肌動蛋白的重組具有直接調(diào)節(jié)突觸傳遞效率的作用，包括長時程增強(LTP)與長時程減弱(LTD)，因此肌動蛋白的動態(tài)變化是突觸可塑性及學習記憶的基礎。雖然cofilin是調(diào)節(jié)肌動

5、蛋白重組的關(guān)鍵分子，但是cofilin調(diào)控學習記憶的具體機制仍然不清楚。
　　 目的:
　　 1.分析LIMK1/cofilin信號通路與BDNF及其受體TrkB的關(guān)系，并深入探討LIMK1/cofilin信號通路參與調(diào)控BDNF誘導的軸突生長的分子機制，為進一步研究BDNF基因突變導致神經(jīng)細胞生長發(fā)育異常疾病的干預措施提供理論依據(jù)。
　　 2.分析LIMK1/cofilin信號通路在學習記憶方面的作用，并深入研

6、究條件性厭惡記憶消退過程IrL腦區(qū)中LIMK1/cofilin信號通路的作用及其機制，為今后研究以LIMK1/cofilin為靶點的臨床相關(guān)疾病的治療措施提供新思路。
　　 方法：
　　 1.LIMK1/cofilin信號通路調(diào)控BDNF誘導的軸突生長的機制研究
　　 1.1、LIMK1與TrkB之間相互作用的檢測
　　 通過免疫共沉淀的方法分別檢測外源性過表達LIMK1與TrkB的HEK293細胞裂解液

7、和正常大鼠腦組織或神經(jīng)元裂解液中LIMK1與TrkB能否相互結(jié)合。為了排除細胞裂解后使不同亞細胞器中的蛋白釋放入裂解液中出現(xiàn)人為的結(jié)合，我們采用免疫熒光共定位的方法檢測兩種蛋白是否存在空間上的重疊性。從而證明TrkB與LIMK1在胞內(nèi)發(fā)生相互作用的可能。
　　 1.2、分析BDNF短時間刺激海馬神經(jīng)元對LIMK1蛋白的影響
　　 體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元用BDNF刺激30分鐘，通過蛋白免疫印跡的方法檢測裂解液中LIMK1的磷

8、酸化及二聚化情況，來反映LIMK1的活性變化。另外分離海馬神經(jīng)元的胞漿和胞膜成分，分別檢測兩種成分中LIMK1含量的變化，來反映LIMK1在胞內(nèi)的分布情況。
　　 1.3、TrkB與LIMK1發(fā)生相互作用的序列分析
　　 采用逐步缺失的方法，設計TrkB不同氨基酸序列突變體，分別和LIMK1進行外源性的免疫共沉淀實驗，篩選出TrkB上與LIMK1相互結(jié)合的氨基酸序列，并將該序列嫁接到不能與LIMK1結(jié)合的T1蛋白上，再次

9、進行外源性的免疫共沉淀實驗，從而證明該氨基酸序列與LIMK1結(jié)合的必要性和充分性。
　　 1.4、設計特異性抑制劑干擾TrkB與LIMK1的結(jié)合
　　 將篩選出來的TrkB中與LIMK1結(jié)合的氨基酸序列與具有穿膜作用短肽Tat進行融合，并對其進行生物素標記，以便于檢測。用免疫熒光染色的方法檢測該人工合成的融合肽是否能夠進入胞內(nèi)，用外源性和內(nèi)源性免疫共沉淀的方法檢測該抑制劑的干擾效率。并應用該抑制劑后再次檢測BDNF刺激對

10、LIMK1的生化特點的影響，來反映BDNF引起的LIMK1的各種變化是否依賴于TrkB與LIMK1的相互作用。
　　 1.5、分析BDNF長時間刺激海馬神經(jīng)元對LIMK1蛋白的影響
　　 體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元給予蛋白合成抑制劑后，再用BDNF刺激不同時間，最長達20h，檢測LIMK1含量的變化，來反映BDNF刺激對LIMK1降解的影響。
　　 1.6、分析藥物干預TrkB與LIMK1相互作用對BDNF誘導的軸突生

11、長的影響
　　 在神經(jīng)元中過表達LIMK1或用小干擾RNA(siRNA)抑制LIMK1的表達，然后用免疫熒光染色的方法檢測BDNF刺激對軸突生長的作用，來反映BDNF促進軸突生長的作用是否依賴于LIMK1。然后用人工合成的Tat融合肽干擾內(nèi)源性TrkB與LIMK1的相互作用，檢測BDNF對軸突生長的促進作用。此外，通過免疫熒光染色方法檢測軸突生長錐(Growthcone)中LIMK1、cofilin的磷酸化及肌動蛋白actin的

12、聚合情況，來反映LIMK1/cofilin信號通路調(diào)控軸突生長的下游機制。
　　 2.LIMK1/cofilin信號通路調(diào)控條件性厭惡記憶消退的機制研究
　　 2.1、條件性味覺厭惡記憶模型的建立及各腦區(qū)中cofilin活性檢測
　　 建立條件性味覺厭惡(CTA)行為學模型，分別在CTA記憶獲得和消退過程的不同時間點取不同區(qū)域腦組織，采用蛋白免疫印跡的方法檢測cofilin的磷酸化水平變化及cofilin的上游激

13、酶LIMK1和磷酸酶SSH1的磷酸化變化情況，來反映cofilin活性變化的分子機制。
　　 2.2、測試藥物干預對行為學的影響
　　 在大鼠IrL腦區(qū)內(nèi)埋管進行微量注射Tat融合肽抑制或增強cofilin活性及抑制GluA2上膜，觀察對條件性味覺厭惡記憶及恐懼記憶消退的影響，來進一步證實cofilin活性對記憶消退的重要性及其機制。
　　 2.3、檢測突觸體及其膜表面中谷氨酸受體的變化
　　 從腦組織中

14、抽提突觸體進行裂解檢測各亞型AMPA受體及NMDA受體的含量變化，或?qū)⑻崛〉耐挥|體進行膜表面蛋白的生物素標記，用含有親和素的瓊脂糖珠子進行沉淀，獲得膜表面蛋白的混合溶液，然后用蛋白免疫印跡的方法檢測突觸體膜表面各谷氨酸受體亞型的含量變化。
　　 2.4、觀察突觸體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化
　　 采用高爾基染色的方法觀察CTA記憶消退過程中及藥物干預cofilin活性后樹突棘形態(tài)和密度的變化，來判斷CTA記憶消退過程中突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的

15、變化是否和突觸傳遞效率的變化相同步。
　　 結(jié)果：
　　 1.LIMK1/cofilin信號通路調(diào)控BDNF誘導的軸突生長的機制研究
　　 1.1、LIMK1與TrkB之間存在相互作用
　　 在體外培養(yǎng)的HEK293細胞中過表達HA標記的LIMK1(HA-LIMK1)和Flag標記的TrkB(Flag-TrkB)，進行免疫共沉淀實驗。HA-LIMK1可以將Flag-TrkB沉淀下來，反之用Flag-Trk

16、B也可以將HA-LIMK1免疫沉淀下來。此外，在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，用免疫熒光染色的方法發(fā)現(xiàn)紅色熒光標記的LIMK1與綠色熒光標記的TrkB存在部分重疊。
　　 1.2、BDNF短時間刺激體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元可以引起LIMK1磷酸化、二聚化及胞內(nèi)分布情況的變化
　　 在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)液中加入BDNF刺激30分鐘，收集細胞裂解液，通過蛋白免疫印跡的方法檢測到p-LIMK1增加。在收集的蛋白裂解液中用不含β巰

17、基乙醇和二巰基蘇糖醇的上樣緩沖液98℃加熱，防止破壞二硫鍵，BDNF刺激后可以出現(xiàn)LIMK1的二聚化。此外，分別抽提胞漿成分和胞膜成分，BDNF刺激30分鐘引起胞漿中的LIMK1降低，胞膜中LIMK1水平升高。
　　 1.3、TrkB蛋白JM區(qū)域中的9個氨基酸介導與LIMK1蛋白的結(jié)合
　　 將TrkB蛋白的胞內(nèi)域進行逐步缺失突變，發(fā)現(xiàn)缺失C末端(ACT)、缺失激酶區(qū)(ATK)后，TrkB仍能與LIMK1結(jié)合，但是進一步

18、缺失近膜區(qū)即胞內(nèi)域全部缺失(JM0)后，則不能與LIMK1結(jié)合。然后將JM區(qū)域細分成5個小片段，仍然采用逐步缺失突變的方法，發(fā)現(xiàn)JM5、JM4能和LIMKi結(jié)合，而JM3、JM2、JM1及JM0不能與LIMK1結(jié)合，因此JM4與JM3之間的差別序列(VIENPQYFG)為介導TrkB與LIMK1結(jié)合的關(guān)鍵序列。此外，我們將這9個氨基酸嫁接到T1蛋白上，發(fā)現(xiàn)原本不能與LIMK1結(jié)合的T1也可以與LIMK1結(jié)合。
　　 1.4、干擾

19、TrkB與LIMK1的結(jié)合抑制BDNF引起的LIMK1的磷酸化、二聚化及胞內(nèi)分布的變化
　　 將篩選出的介導TrkB與LIMK1結(jié)合的氨基酸序列嫁接到穿膜肽Tat上(Tat-JMBox4)，發(fā)現(xiàn)該融合肽能成功的進入神經(jīng)細胞內(nèi)，并能有效抑制TrkB與LIMK1的相互結(jié)合。用該人工合成的短肽封閉TrkB與LIMK1的相互作用后，發(fā)現(xiàn)BDNF引起的LIMK1的磷酸化、二聚化及胞內(nèi)分布變化的現(xiàn)象被抑制。
　　 1.5、BDNF長

20、時間刺激可以延緩LIMK1的降解
　　 在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)液中，加入BDNF分別刺激1、5、15、20h后收集裂解液，發(fā)現(xiàn)LIMK1的蛋白水平升高。如果在加入BDNF之前，提前加入蛋白合成抑制劑放線菌酮(cycloheximide)，發(fā)現(xiàn)加入BDNF組比不加BDNF組，LIMK1的半衰期延長，而用Tat-JMBox4干擾TrkB與LIMK1的相互作用后，BDNF對LIMK1的穩(wěn)定作用被抑制。
　　 1.6、BD

21、NF誘導軸突生長依賴于TrkB與LIMK1的相互作用
　　 在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中過表達LIMK1或者用小干擾RNA(siRNA)干擾LIMK1的表達，然后再用BDNF刺激，發(fā)現(xiàn)過表達LIMK1組神經(jīng)元軸突快速生長，而干擾LIMK1表達后，BDNF促進軸突生長的作用被抑制。而且，用Tat-JMBox4抑制TrkB與LIMK1相互作用后，BDNF誘導軸突生長的功能被抑制。
　　 2.LIMK1/cofilin信號通路調(diào)控

22、條件性厭惡記憶消退的機制研究
　　 2.1、CTA記憶消退過程IrL腦區(qū)中cofilin活性增高
　　 消退測試第一天(E1)不同時間點取腦組織進行檢測，發(fā)現(xiàn)p-cofilin在測試后0.5h和2h明顯升高。第三天消退測試(E3)后0.5h與第一天進行對比，發(fā)現(xiàn)p-cofilin明顯降低，即cofilin活性增高。
　　 2.2、CTA記憶消退過程中p-LIMK1和p-SSH1水平均降低
　　 消退第三天

23、(E3)p-LIMK1和p-SSH1水平比消退第一天(E1)明顯降低，即在CTA記憶消退過程中LIMK1活性降低而SSH1活性升高。
　　 2.3、藥物干預cofilin活性影響CTA記憶的消退進程
　　 在前三次記憶消退測試后，在IrL腦區(qū)立即注射Tat-Ser3增加cofilin活性可以加速CTA記憶消退，而注射Tat-pSer3降低cofilin活性則阻礙CTA記憶消退。然而，在前三次記憶消退后4h，在IrL腦區(qū)中

24、給予這兩種藥物均對CTA記憶消退沒有影響。
　　 2.4、CTA記憶消退過程中突觸體及其膜表面AMPA受體含量增加
　　 在CTA記憶消退過程中，IrL腦區(qū)的突觸體及其膜表面G1uA1和GluA2的含量顯著升高，而GluA3、G1uA4及NR-1則沒有明顯變化。但是，CTA記憶消退過程中，IrL腦區(qū)總的腦組織裂解液中GluA1和GluA2的含量沒有變化。
　　 2.5、藥物干預cofilin活性影響突觸后AMPA

25、受體水平
　　 在CTA記憶消退的前三天，用Tat-Ser3增加cofilin活性，可以引起G1uA1和GluA2在突觸體膜表面的含量，而用Tat-pSer3抑制cofilin活性則顯著降低了GluA1和GluA2在突觸體膜表面的含量。
　　 2.6、CTA記憶消退過程中突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)沒有明顯變化
　　 在CTA記憶消退過程中，樹突棘頭頸比(head/neckratio)及樹突棘的密度均未發(fā)生明顯的變化，即使用Ta

26、t短肽干擾cofilin的活性也對樹突棘的形態(tài)及密度沒有影響。
　　 2.7、GluA2上膜抑制劑阻礙CTA記憶的消退
　　 在CTA記憶消退前三天給予GluA2上膜的抑制劑(Tat-pepR845A)，或者在給予Tat-Ser3增加cofilin活性的同時給予GluA2上膜的抑制劑，發(fā)現(xiàn)CTA記憶消退進程減慢。
　　 結(jié)論：
　　 1.BDNF引起LIMK1蛋白發(fā)生磷酸化、二聚化及胞內(nèi)重新分布的現(xiàn)象依賴

27、于TrkB與LIMK1的相互作用，LIMK1蛋白的二聚化使LIMK1蛋白穩(wěn)定性增加，活性增強，通過磷酸化cofilin蛋白促進肌動蛋白的聚合，從而促進軸突的生長。
　　 2.記憶消退過程中激酶LIMK1蛋白和磷酸酶SSH1蛋白的協(xié)同作用，使得cofilin蛋白活性增強，雖然cofilin蛋白活性的增加沒有引起樹突棘的大小和密度發(fā)生變化，但是cofilin蛋白活性的增高促進了AMPA受體向突觸體及膜表面轉(zhuǎn)運，引起突觸后傳遞效率增加

28、，從而加速了記憶消退進程。
　　 創(chuàng)新點
　　 1.LIMK1/cofilin信號通路調(diào)控BDNF誘導的軸突生長的機制研究
　　 1.1、研究發(fā)現(xiàn)了一種能與TrkB蛋白相互作用的新分子即LIMK1蛋白，并且找出了TrkB分子中與LIMK1相結(jié)合的具體的氨基酸序列。
　　 1.2、發(fā)現(xiàn)BDNF刺激海馬神經(jīng)元對LIMK1存在兩種不同的影響，即短時間作用可促進LIMK1活性增加并引起LIMK1在胞內(nèi)重新分布，長