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文檔簡介
1、蛋白精氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶1(Protein Arginine Methlytransferase1,PRMT1)是蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶家族的主要成員。PRMT1有多種組氨酸和非組氨酸底物,它通過甲基化這些底物調(diào)控蛋白-蛋白間和蛋白-核酸間的相互作用,發(fā)揮表觀遺傳轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、RNA剪接、RNA輸出和信號傳導(dǎo)功能。PRMT1通過甲基化Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Runt-related Transcription Factor1,RUNX1)激活轉(zhuǎn)
2、錄調(diào)節(jié)造血。在AML1-ETO的急性髓系白血?。ˋcute Myeloid Leukemia,AML)中,PRMT1與AML1-ETO相互作用,敲低PRMT1的表達能減少由AML1-ETO激活的相關(guān)基因表達,減少白血病細胞的增殖并抑制它們的自我更新。PRMT1在新診斷出的兒童急性淋巴細胞白血病患者中的表達顯著增高。RNA結(jié)合蛋白15(RNA Binding Motif Protein15,RBM15)是由位于1號染色體的上的RBM15/
3、OTT基因編碼的RNA結(jié)合蛋白。它能與核RNA輸出因子1(Nuclear RNAexport factor1,NXF1)相結(jié)合并直接識別RNA輸出元素(RNA Transport Element,RTE),輔助輸出含有RTE的基因,促進基因的表達,參與輸出通路發(fā)揮核輸出功能。RBM15與c-Myc結(jié)合調(diào)節(jié)成人造血干細胞向巨核細胞分化。在RBM15基因敲除的成年小鼠中髓細胞及巨核細胞增生異常,并且由于在前B細胞的分化階段受到阻滯,導(dǎo)致使外
4、周B細胞缺失。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRMT1甲基化RBM15蛋白的R578位點,導(dǎo)致甲基化的RBM15蛋白經(jīng)過E3連接酶介導(dǎo)的泛素化降解,RBM15直接與RUNX1和GATA1的pre-mRNA的內(nèi)含子區(qū)域結(jié)合后與SF3B1作用調(diào)控它們的RNA可變剪接。但是PRMT1-RBM15在正常造血干細胞向巨核細胞及髓系細胞分化過程中的作用機制仍不清楚。
眾多研究發(fā)現(xiàn)許多造血系統(tǒng)疾病發(fā)生表觀遺傳調(diào)控異常和RNA剪切功能的異常。骨髓增生
5、異常綜合征(Myelodysplastic Syndrome,MDS)是一組異質(zhì)的克隆性干細胞疾病。它的特征是至少一個造血譜系的發(fā)育不良和無效造血,且具有發(fā)展為急性髓系白血病的危險?;驕y序結(jié)果顯示大約80%的MDS患者攜帶基因突變,例如表觀遺傳調(diào)節(jié)基因(TET2,ASXL1,DNMT3A,IDH1,IDH2,EZH2),轉(zhuǎn)錄因子(ETV6,RUNX1,TP53),信號傳導(dǎo)蛋白(CBL,JAK2,KRAS,NRAS)和與RNA剪接機制相
6、關(guān)的基因(SF3B1,SRSF2,U2AF1,ZRSR2)。80%以上的MDS亞型環(huán)形鐵粒幼細胞性貧血的患者發(fā)生剪切因子3b亞型1(Splicing Factor3b Subunit1,SF3B1)的基因突變。SF3B1K700E是SF3B1突變最常見的突變位點。SF3B1的突變?nèi)绾螌?dǎo)致紅細胞生成缺陷的分子機制仍不清楚。RBM15的RIP-seq分析顯示,RBM15與SF3B1和TAL1的內(nèi)含子區(qū)域相結(jié)合。TAL1基因編碼一個具有螺旋-
7、環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子,是在造血過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。它對早期造血和成人造血中紅細胞和巨核細胞生成有重要作用。TAL1基因有多個啟動子,可編碼產(chǎn)生全長的TAL1(TAL1 full-length,TAL1fl)蛋白及短的TAL1(TAL1 short-form,TAL1s)蛋白。此外,TAL1fl mRNA可通過使用在N-末端區(qū)域部分的不同翻譯起始位點產(chǎn)生不同大小的蛋白質(zhì)。TAL1s的N末端沒有DNA結(jié)合域,TAL1s的過表達促進了小鼠骨
8、髓細胞的紅細胞分化。所以我們推測PRMT1-RBM15、SF3B1和TAL1之間的相互作用的失調(diào)可能在MDS的發(fā)病機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究第二部分中我們重點闡述了PRMT1-RBM15、SF3B1和TAL1之間的關(guān)系。
急性巨核細胞白血?。ˋcute Megakaryoblastic Leukemia,AMKL)中t(1;22)(p13;q13)染色體易位比較常見,這種易位使得1號染色體上RBM15基因和22號染色體上MKL
9、1基因形成融合基因RBM15-MKL1(又叫OTT-MAL)。RBM15和MKL1都是巨核細胞分化的重要基因,RBM15-MKL1融合基因?qū)氲男∈罂梢园l(fā)生像RBM15敲除小鼠一樣的巨核細胞分化缺陷。雖然RBM15-AMKL轉(zhuǎn)基因小鼠AMKL的發(fā)病率很低,但是當(dāng)將骨髓增殖白血病基因的突變體(Myloproliferative Leukemia virus mutant,MPLW515L)轉(zhuǎn)入RBM15-MKL1骨髓后,它的AMKL的發(fā)病
10、率為100%。6133細胞系是從RBM15-MKL1轉(zhuǎn)基因的小鼠脾臟分離出來的細胞系,它的存活需要依賴干細胞因子(Stem Cell Factor,SCF)。我們前期實驗證實了在6133細胞里過表達MPLW515L時激活了PRMT1的表達,并能夠使6133細胞呈現(xiàn)無依賴因子的生長。生物信息技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),PRMT1在急性巨核細胞白血病中表達增高。DB75已經(jīng)在不同的生物系統(tǒng)被用作研究PRMT1的功能,它能透過293T細胞的細胞膜并抑制PR
11、MT1的活性。我們前期研究發(fā)現(xiàn)PRMT1抑制劑DB75能夠促進造血干細胞向巨核細胞分化成熟,并且能逆轉(zhuǎn)PRMT1導(dǎo)致的巨核細胞分化障礙。在正在培養(yǎng)的白血病細胞MEG01細胞的培養(yǎng)基中加入20μM的DB75,72h后顯著抑制了它們的生長。但是RBM15-MKL1融合基因?qū)е碌陌籽∈欠褚簿哂蠵RMT1表達增高的特性,以及抑制PRMT1的活性能否抑制白血病的異常增殖需要我們進一步研究。
綜上所述,本研究主要從三個部分探討PRMT1
12、-RBM15調(diào)控通路在正常造血調(diào)控和疾病中的作用機制。第一,PRMT1-RBM15調(diào)控通路在正常紅系及巨核系細胞分化過程中的作用機制;第二,PRMT1-RBM15調(diào)控通路在SF3B1K700E突變相關(guān)紅系異常造血中的作用機制;第三,PRMT1-RBM15調(diào)控通路在RBM15-MKL1融合基因相關(guān)AMKL中的作用機制。此研究的目的旨在探討PRMT1-RBM15調(diào)控通路是否能夠作為治療相關(guān)造血系統(tǒng)疾病的潛在靶點。
第一部分:PRM
13、T1-RBM15調(diào)控通路在正常紅系和巨核系分化過程中的作用機制研究
目的
以正常臍血干細胞為研究對象,研究PRMT1-RBM15調(diào)控通路在正常造血干細胞向巨核細胞及紅細胞分化過程中的作用。
方法:
收集正常孕婦胎兒臍血,肝素抗凝,應(yīng)用淋巴細胞分離液分選出單個核細胞,用磁珠分選儀分離臍血CD34+細胞。用磷酸鈣包裝病毒的方法分別包裝PRMT1,RBM15,shPRMT1,shRBM15#1,shRB
14、M15#2慢病毒,用PEG6000的方法把這些病毒濃縮為原體積的1/100。用這些病毒按照常規(guī)侵染懸浮細胞的方法分別侵染CD34+細胞。侵染48h后,用流式細胞學(xué)的方法或者用嘌呤霉素獲得陽性細胞,并把這些陽性細胞分別在2IU/ml的EPO和50ng/ml的TPO的培養(yǎng)基中培養(yǎng),7天后應(yīng)用流式細胞學(xué)方法分別檢測代表紅細胞生成的表面抗原CD71和代表成熟巨核細胞表面抗原CD41,CD42的表達。
結(jié)果:
1.PRMT1-
15、RBM15調(diào)控通路調(diào)控著造血干細胞向巨核細胞分化。在CD34+臍血干細胞中過表達RBM15或者用PRMT1抑制劑(DB75)抑制PRMT1活性時,生成的成熟巨核細胞的數(shù)目增多;過表達PRMT1或者用shRNA的方法敲低RBM15時,生成的成熟巨核細胞的數(shù)目減少。
2.PRMT1-RBM15調(diào)控通路調(diào)控著造血干細胞向紅細胞分化。在CD34+臍血干細胞中過表達PRMT1或者用shRNA的方法敲低RBM15時,生成的紅細胞增多;過表
16、達RBM15或者用PRMT1抑制劑(DB75)抑制PRMT1活性時,生成的紅細胞減少。
第二部分:PRMT1-RBM15調(diào)控通路在SF3B1K700E突變相關(guān)紅系異常造血中的作用機制研究
目的:
研究PRMT1-RBM15調(diào)控通路在SF3B1K700E引起的骨髓增生異常綜合征中的作用機制。
方法:
1.用Real-time PCR及Western Blot的方法分析PRMT1-RBM15
17、調(diào)控通路的改變是否影響TAL1兩種異構(gòu)體的表達。
2.構(gòu)建Flag-TAL1s,F(xiàn)lag-TAL1fl慢病毒質(zhì)粒,用慢病毒原液侵染K562細胞,48h后,用流式細胞儀分選出陽性細胞。提取這些陽性細胞的RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,Real-time PCR的方法分析內(nèi)源性的TAL1s、TAL1fl、ALAS2、β-globin和γ-globin的表達。用Benzidine染料分別對上述的陽性細胞進行染色,顯微鏡計數(shù)經(jīng)Benzidi
18、ne染色的陽性細胞,了解紅細胞比例。構(gòu)建TAL1s,TAL1fl的慢病毒質(zhì)粒,用磷酸鈣的方法包裝病毒,用PEG6000的方法把病毒按照1∶100的比例濃縮。用濃縮后的病毒按照侵染懸浮細胞的方法侵染人類臍血CD34+細胞。48h后,用流式細胞儀分選出病毒侵染陽性細胞,并分別把這些陽性細胞培養(yǎng)在含有2IU/ml的EPO的培養(yǎng)基中,7天后流式細胞學(xué)檢測代表紅細胞生成的表面抗原CD71的表達。
3.用磷酸鈣的方法分別將Flag-TAL
19、1s、Flag-TAL1fl、Flag-TAL1s+ETO2、Flag-TAL1fl+ETO2轉(zhuǎn)入293T細胞中,48h后收取總蛋白,免疫共沉淀純化出Flag蛋白后用Western Blot的的方法檢測ETO2的表達。分別收取在K562細胞中過表達Flag-TAL1s,F(xiàn)lag-TAL1fl的陽性細胞的總蛋白,用上述同樣的方法檢測檢測ETO2的表達。
4.野生型Flag-SF3B1和突變型SF3B1K700E慢病毒質(zhì)粒來自美國
20、Sloan-Kettering癌癥中心,提取質(zhì)粒,送金唯智測序公司測序。測序正確后,用磷酸鈣的方法包裝慢病毒,用病毒原液侵染K562細胞,48h后,用流式細胞儀分選出病毒侵染陽性細胞,收取細胞的總蛋白,免疫共沉淀的方法純化出Flag蛋白,用Western Blot的方法分析RBM15的表達。
結(jié)果:
1.PRMT1-RBM15調(diào)控通路調(diào)控著TAL1的可變剪接。PRMT1的表達增高或者用shRNA的方法使RBM15的表
21、達敲低時,TAL1s/TAL1fl的mRNA比率和蛋白比率增高,產(chǎn)生的TAL1s增多。RBM15的表達增高和用shRNA敲低PRMT1的表達或者用PRMT抑制劑DB75使PRMT1活性減低時,TAL1s/TAL1fl的mRNA比率和蛋白比率減低,產(chǎn)生的TAL1fl增多。
2.TAL1s能促進紅細胞的成熟分化。當(dāng)Flag-TAL1s和Flag-TAL1fl在K562細胞中過表達時,它們的細胞沉淀變紅;與TAL1fl過表達的K56
22、2細胞相比,TAL1s過表達的K562細胞細胞沉淀變得更紅。Real-time PCR分析顯示TAL1s的表達增高沒有使內(nèi)源性的TAL1s或TAL1fl的mRNA水平增高,但是TAL1fl的表達增高使內(nèi)源性的TAL1fl增高,而內(nèi)源性的TAL1s增高并不明顯。TAL1s的表達增高促進K562細胞產(chǎn)生更多的β-globin的mRNA,TAL1fl和TAL1s激活了負責(zé)血紅素生成基因ALAS2的轉(zhuǎn)錄。TAL1s過表達的K562細胞經(jīng)Benz
23、idine染色的陽性細胞比例高于TAL1fl過表達K562細胞的陽性細胞比例。雖然在臍血干細胞中過表達TAL1s和TAL1fl都能使紅細胞生成增多,但是TAL1s能更有效地生成更多的紅細胞。同樣在臍血干細胞中過表達PRMT1也能使造血干細胞產(chǎn)生更多的CD71紅細胞。
3.TAL1兩種異構(gòu)體與轉(zhuǎn)錄抑制因子ETO2的結(jié)合不同。不管是在293T細胞中或者在K562細胞中,TAL1fl與ETO2相互結(jié)合,但是TAL1s不與ETO2結(jié)合
24、。有文獻指出ETO2抑制紅系發(fā)育,所以TAL1s通過不與ETO2結(jié)合促進紅系發(fā)育。
4.SF3B1K700E突變體與RBM15的相互作用增強影響TAL1的mRNA可變剪接。與野生型的SF3B1相比,RBM15與突變型的SF3B1結(jié)合增多。突變體SF3B1使TAL1fl的mRNA水平增高更多進而使TAL1s/TAL1fl的mRNA比率減少。野生型的SF3B1使血紅蛋白生成相關(guān)基因ALAS2、γ-globin和β-globin的m
25、RNA水平增高,但是SF3B1突變體不增加它們的mRNA水平。
第三部分:PRMT1-RBM15調(diào)控通路在RBM15-MKL1融合基因相關(guān)AMKL中的作用機制研究
目的:
研究PRMT1-RBM15調(diào)控通路在RBM15-MKL1融合基因?qū)е碌募毙跃藓思毎籽≈械淖饔脵C制。
研方法:
1.按照第二部分中分離臍血CD34+細胞的方法分離臍血CD34+細胞,用磷酸鈣包裝病毒的方法包裝RBM1
26、5-MKL1和MPLW515L慢病毒,PEG6000的方法把病毒原液濃縮為原體積1/100。用常規(guī)侵染懸浮細胞的方法分別用RBM15-MKL1,RBM15-MKL1+MPLW515L,MPLW515L慢病毒侵染CD34+細胞。48h后,用流式細胞儀分選出陽性或雙陽性的細胞。1)培養(yǎng)在CD34+細胞成長的培養(yǎng)基中,每天細胞計數(shù);2)利用細胞克隆分析試劑盒做細胞連續(xù)克隆形成分析;3)培養(yǎng)在巨核細胞分化培養(yǎng)基中,7天后使用流式細胞學(xué)方法分析細
27、胞表面CD41 CD42的表達。4)Real-time PCR方法分析PRMT1的mRNA水平,流式細胞學(xué)方法分析PRMT1蛋白水平。
3.在1中分選的過表達RBM15-MKL1+MPLW515L的雙陽性細胞中加入PRMT1抑制劑DB75。1)應(yīng)用細胞活性分析試劑盒分析DB75對細胞活性的影響;2)利用細胞克隆試劑盒做細胞連續(xù)克隆形成分析;3)培養(yǎng)在巨核細胞培養(yǎng)基中并在7天后使用流式細胞學(xué)方法分析細胞表面CD41 CD42的表
28、達。
結(jié)果:
1.RBM15-MKL1融合蛋白和MPLW515L突變體共同作用能使臍血干細胞長期增殖。當(dāng)RBM15-MKL1和MPLW515L共同表達在臍血CD34+細胞時能夠在造血干細胞培養(yǎng)基中長期存活,并且能夠在含有CD34+細胞成長的細胞因子混合物的甲基纖維素的培養(yǎng)基中長期增殖。RBM15-MKL1+MPLW515L共同表達抑制了造血干細胞向巨核細胞分化。不管是mRNA或者是蛋白水平,PRMT1在RBM15-M
29、KL1和MPLW515L共同表達的臍血CD34+細胞中都增高。
2.PRMT1抑制劑DB75能抑制RBM15-MKL1+MPLW515L轉(zhuǎn)化的CD34+細胞的增殖。當(dāng)我們在RBM15-MKL1+MPLW515L共同表達的細胞加入DB75時,這些細胞在三天內(nèi)停止生長并死亡。DB75能使RBM15-MKL1+MPLW515L共同表達的細胞在甲基纖維素培養(yǎng)基中培養(yǎng)時,細胞克隆形成停止。PRMT1抑制劑DB75能夠逆轉(zhuǎn)RBM15-MK
30、L1和MPLW515L導(dǎo)致的白血病模型的巨核細胞成熟障礙,使成熟巨核細胞數(shù)目增多。
結(jié)論:
1.PRMT1-RBM15調(diào)控通路在正常造血干細胞向巨核細胞及紅細胞分化的過程中具有重要的調(diào)控作用。
2.在SF3B1K700E突變的骨髓增生異常綜合征中,RBM15與SF3B1K700E的結(jié)合增強,導(dǎo)致TAL1s的減少從而引起紅細胞成熟分化減少。PRMT1的增高引起TAL1s的增加引起與紅細胞成熟分化相關(guān)的基因AL
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