鎘暴露致小鼠卵巢顆粒細(xì)胞激素合成障礙中Sf-1基因的表達(dá)及其DNA的甲基化.pdf

1、目的：
　　通過(guò)體外培養(yǎng)26日齡小鼠卵巢顆粒細(xì)胞，觀察不同濃度、不同時(shí)間鎘暴露后顆粒細(xì)胞形態(tài)及激素分泌功能的改變，探討鎘暴露致未成年小鼠卵巢顆粒細(xì)胞激素合成障礙中Sf-1基因的表達(dá)及其DNA的甲基化情況，為進(jìn)一步研究鎘暴露對(duì)卵巢細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制提供新思路。
　　方法：
　　提取26日齡雌性ICR小鼠卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁，形態(tài)穩(wěn)定后，將細(xì)胞隨機(jī)分為四組，分別加入含終濃度為0、10、20、40μM的氯

2、化鎘的細(xì)胞培養(yǎng)液，待染毒結(jié)束后處理。分別于染毒2h、4h、6h、8h后進(jìn)行：1、倒置顯微鏡下觀察顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化；2、ELISA法檢測(cè)顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中E2及P4濃度；3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)Sf-1基因mRNA表達(dá)變化情況；4、Western blotting法檢測(cè)SF-1蛋白表達(dá)變化情況；5、于染毒6 h后，提取顆粒細(xì)胞DNA，結(jié)合堿基特異性酶切反應(yīng)與MALDI-TOF-MS檢測(cè)原理，運(yùn)用Sequenom公司的MassARRA

3、Y檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)Sf-1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化情況。
　　結(jié)果：
　　1.鎘對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響：隨著鎘染毒劑量的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，染毒組與對(duì)照組比較，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞突觸收起，細(xì)胞變圓，折光性變強(qiáng)，高劑量組可見(jiàn)部分漂浮的死細(xì)胞，且隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，死細(xì)胞增多。
　　2.（1）鎘對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞E2分泌水平的影響：①同一染毒時(shí)間下，隨著染毒劑量的增加，顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素水平存在

4、下降趨勢(shì)（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P<0.01）。其中分別染毒2 h和4 h后，20μM、40μM組細(xì)胞培養(yǎng)液中的E2水平低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；染毒6 h和8 h后，10μM、20μM、40μM組細(xì)胞培養(yǎng)液中的E2水平明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。②同一染毒劑量下，隨著染毒時(shí)間的增加，顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中雌激素水平存在升高的趨勢(shì)（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P<0.05）.其中，在10μM劑量下，染毒4 h后培養(yǎng)液中 E2水

5、平與染毒2 h后的水平相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；Control組、20μM、40μM染毒劑量下，培養(yǎng)4 h、8 h后，培養(yǎng)液中E2水平與培養(yǎng)2 h后的水平相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　（2）鎘對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞P4分泌水平的影響：①同一染毒時(shí)間不同染毒劑量的變化：染毒2 h后，10μM、20μM組培養(yǎng)液中的P4水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；染毒4 h后，隨著染毒劑

6、量的增加，顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中P4水平存在下降趨勢(shì)（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P<0.05），其中20μM、40μM組培養(yǎng)液中的P4水平明顯低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；分別染毒6 h和8 h后各劑量組培養(yǎng)液中的P4水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。②同一染毒劑量不同染毒時(shí)間的變化：Control組、10μM、40μM染毒劑量下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)液中P4水平存在升高趨勢(shì)（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P<0.05）。其中，0μM組經(jīng)

7、8h培養(yǎng)后，培養(yǎng)液中P4水平與染毒2 h后的比較明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在10μM劑量下，染毒4 h、6 h、8 h后培養(yǎng)液中 P4水平與染毒2 h后的比較明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在20μM劑量下，染毒4 h后培養(yǎng)液中 P4水平與染毒2 h后的比較明顯降低（P<0.05）。
　　3．鎘對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞Sf-1基因的mRNA表達(dá)的影響：（1）同一染毒時(shí)間不同染毒劑量變化：分別染毒2 h后，各

8、染毒組顆粒細(xì)胞Sf-1基因mRNA表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；分別染毒4 h、6 h、8 h后，各染毒組 Sf-1基因 mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且4 h、6 h、8 h實(shí)驗(yàn)組Sf-1基因的mRNA表達(dá)水平隨著染毒劑量的增加存在著下降的趨勢(shì)（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P<0.01）。（2）同一染毒劑量不同染毒時(shí)間變化：在10μM、20μM、40μM染毒劑量下，Sf-1基因mRNA表達(dá)水

9、平隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而下降（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P<0.05）。其中，10μM劑量下染毒8 h后，Sf-1基因mRNA表達(dá)水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；20μM劑量下染毒6 h后，Sf-1基因mRNA表達(dá)水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；40μM劑量下分別染毒6 h、8 h后，Sf-1基因mRNA表達(dá)水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0

10、.05）。
　　4.鎘對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞SF-1蛋白表達(dá)的影響：（1）同一染毒時(shí)間不同染毒劑量變化：分別染毒2 h后，各染毒組顆粒細(xì)胞SF-1蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；分別染毒4 h后，20μM、40μM組SF-1蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；分別染毒6 h、8 h后，各染毒組SF-1蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且4h、6h、8h實(shí)驗(yàn)

11、組SF-1蛋白表達(dá)水平隨著染毒劑量的增加存在著下降的趨勢(shì)（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P<0.01）。（2）同一染毒劑量不同染毒時(shí)間變化：在10μM、20μM、40μM染毒劑量下，SF-1蛋白表達(dá)水平隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而下降（趨勢(shì)性檢驗(yàn)P<0.01）。其中，10μM劑量下染毒6 h、8 h后，SF-1蛋白表達(dá)水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在20μM、40μM劑量下，染毒4 h、6 h、8 h后，SF-1蛋白表達(dá)

12、水平與染毒2 h后的水平相比明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　5、鎘對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞Sf-1基因DNA甲基化的影響：用Sequenom DNA甲基化檢測(cè)平臺(tái)實(shí)際檢測(cè)到的CG位點(diǎn)為9個(gè)，但是由于第7、8、9位點(diǎn)有些劑量組CG位點(diǎn)的甲基化率為0，所以最終納入分析的為1-6位點(diǎn)，數(shù)據(jù)經(jīng)整理分析結(jié)果顯示Sf-1基因各組總體甲基化率均呈現(xiàn)較低甲基化，且與溶劑對(duì)照組比較，DAC處理組及各CdCl2染毒組Sf-1基因DNA啟動(dòng)子

13、區(qū)CG位點(diǎn)甲基化率無(wú)明顯改變，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、在本次實(shí)驗(yàn)條件下，鎘對(duì)小鼠卵巢顆粒細(xì)胞存在一定的毒性作用，表現(xiàn)在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變，及一定劑量范圍內(nèi)抑制卵巢顆粒細(xì)胞分泌雌二醇和孕酮。
　　2、體外鎘（10-40μM）暴露后，Sf-1基因 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)，可能是鎘致激素分泌及合成障礙的重要機(jī)制之一。
　　3、鎘暴露卵巢顆粒細(xì)胞后Sf-1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA呈現(xiàn)低甲基化狀態(tài)