脊髓TLR9在大鼠脛骨癌痛中的作用及電針作用觀察.pdf

1、由外周神經(jīng)損傷、炎癥和腫瘤引起的神經(jīng)病理性疼痛、炎癥痛和癌痛是最常見的三類慢性痛?，F(xiàn)今癌癥已成為威脅人類生存的重要疾病之一。眾所周知，腫瘤引起的疼痛嚴(yán)重破壞了患者的生活質(zhì)量，其中以由乳腺癌、前列腺癌、肺癌和卵巢癌骨轉(zhuǎn)移引起的骨癌痛最為常見，也最為嚴(yán)重。有研究認(rèn)為，癌痛可能有神經(jīng)痛和炎癥痛兩種成分存在，但與炎癥痛和神經(jīng)痛又不完全相同。在癌痛早期，由于腫瘤與周圍組織釋放炎性因子而表現(xiàn)出與炎癥痛相似的癥狀；在癌痛晚期由于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)浸潤(rùn)引起

2、神經(jīng)壓迫和損傷，從而表現(xiàn)出與神經(jīng)痛類似的癥狀。這提示癌痛機(jī)理有其獨(dú)特性和復(fù)雜性。因此將癌痛與神經(jīng)痛、炎癥痛做比較性研究對(duì)揭示癌痛獨(dú)特的機(jī)理有重要的理論和臨床意義。
　　 Toll樣受體(Toll like receptor，TLRs)是一個(gè)模式識(shí)別受體家族，屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其13個(gè)家族成員。它們主要通過(guò)識(shí)別保守的病原相關(guān)分子模式(Pathogen-Associated Molecular Pattern，PAMP)

3、，感知病原微生物的存在，對(duì)其產(chǎn)生免疫炎癥反應(yīng)。最近發(fā)現(xiàn)TLRs還能識(shí)別受損細(xì)胞或壞死細(xì)胞來(lái)源的內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)。這些內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)和PAMP類似，在外周可以促進(jìn)抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells，APC)的成熟進(jìn)而激發(fā)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。熱休克蛋白(Heat shock protein，HSP)是TLRs常見的內(nèi)源性激動(dòng)劑，HSP與TLRs結(jié)合后，能通過(guò)髓樣分化因子(myeloid differentiation

4、factor88，MyD88)激活下游信號(hào)通路。已有研究發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的TLR2和TLR4在炎癥痛與神經(jīng)痛的發(fā)生發(fā)展中有重要的作用，我實(shí)驗(yàn)室前期的工作也發(fā)現(xiàn)TLR4在癌痛的發(fā)生與維持中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。TLR9是TLRs家族中重要一員，近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)TLR9不僅在外周免疫細(xì)胞中表達(dá)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也有廣泛表達(dá)，并能調(diào)節(jié)下游的IL-1β、TNF-α等炎性細(xì)胞因子，這些炎性因子在痛覺敏化的過(guò)程中有重要的作用。那么脊髓TLR9在癌痛的發(fā)生

5、與發(fā)展中作用如何呢?因此本研究深入地觀察了TLR9在癌痛中的作用。
　　 祖國(guó)醫(yī)學(xué)對(duì)疼痛有著深刻的認(rèn)識(shí)，《黃帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為疼痛產(chǎn)生的重要原因是“經(jīng)脈流行不止，環(huán)周不休，泣而不行，脈中則氣不通，故卒然而痛。”，此外“風(fēng)、寒、濕三氣雜至合而為痹”。因此“不通則痛”，淤血阻滯，痰凝積結(jié)，濕邪內(nèi)阻，毒火結(jié)聚等阻滯經(jīng)絡(luò)，引起疼痛。針刺是祖國(guó)醫(yī)學(xué)的精華之一，具有作用廣，毒副作用小，經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。針刺能夠疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)節(jié)氣血。大量的臨床實(shí)踐證明

6、，針刺療法對(duì)急、慢性疼痛均有良好的治療效果，但是針刺對(duì)骨癌痛的鎮(zhèn)痛作用尚存在爭(zhēng)議，針刺鎮(zhèn)痛的機(jī)理也不是十分清楚。因此本研究觀察了電針對(duì)不同性質(zhì)疼痛的鎮(zhèn)痛作用，以期進(jìn)一步闡述骨癌痛的獨(dú)特機(jī)理并探索針刺鎮(zhèn)痛新的機(jī)理。
　　 綜上所述，本論文擬開展下列研究：
　　 1.建立癌痛、炎癥痛和神經(jīng)痛模型并比較其行為學(xué)差異
　　 (1)參照本研究組毛應(yīng)啟梁等之前的報(bào)道，建立大鼠脛骨癌痛模型。采用機(jī)械性痛覺超敏與熱痛覺過(guò)敏等指標(biāo)

7、檢驗(yàn)其行為學(xué)特征。
　　 (2)建立新的大鼠脛骨炎癥痛模型。采用病理學(xué)、血常規(guī)分析、免疫熒光、機(jī)械性痛覺超敏與熱痛覺過(guò)敏等方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)并檢驗(yàn)其行為學(xué)特征。
　　 (3)參照Woolf等建立的SNI(spared nerve injury)模型，并進(jìn)行改進(jìn)，新建大鼠脛神經(jīng)病理性疼痛模型，并采用機(jī)械性痛覺超敏與熱痛覺過(guò)敏等指標(biāo)檢驗(yàn)其行為學(xué)特征。
　　 (4)通過(guò)給予三種疼痛模型大鼠抗炎鎮(zhèn)痛藥塞來(lái)昔布灌胃治療，比較

8、三種疼痛模型大鼠對(duì)塞來(lái)昔布的鎮(zhèn)痛敏感性。
　　 2.比較脊髓TLR9在三種疼痛模型中的作用及其機(jī)制
　　 (1)運(yùn)用RT-PCR方法在mRNA水平比較TLR9在三種疼痛模型中表達(dá)變化。
　　 (2)運(yùn)用Western Blot方法在蛋白水平比較TLR9在三種疼痛模型中表達(dá)變化。
　　 (3)采用免疫熒光雙標(biāo)的方法檢測(cè)TLR9在脛骨癌痛大鼠脊髓內(nèi)細(xì)胞定位。
　　 (4)通過(guò)鞘內(nèi)注射TLR9的拮抗劑O

9、DN2088，比較其對(duì)三種疼痛模型大鼠機(jī)械性痛閾的影響。
　　 (5)通過(guò)鞘內(nèi)注射TLR9內(nèi)源性配體HSP90的抑制劑，17-DMAG(17-dimethylaminoethylamino-17-demethoxygeldanamycin hydrochloride)，比較其對(duì)三種疼痛模型大鼠機(jī)械性痛閾的影響。
　　 (6)通過(guò)Bio-Plex懸液芯片方法檢測(cè)TLR9通過(guò)下游的細(xì)胞因子IL-1β、IL-4、IL-6、IL

10、-10與TNF-α的表達(dá)變化。
　　 3.比較電針對(duì)不同慢性痛的鎮(zhèn)痛作用及其對(duì)TLR9表達(dá)的影響
　　 (1)觀察多次電針對(duì)大鼠脛骨癌痛的鎮(zhèn)痛作用及脊髓TLR9表達(dá)的影響。
　　 (2)觀察多次電針對(duì)大鼠脛骨炎癥痛的鎮(zhèn)痛作用及脊髓TLR9表達(dá)的影響。
　　 (3)觀察多次電針對(duì)大鼠脛神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛作用及脊髓TLR9表達(dá)的影響。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 1.建立脛骨癌痛、脛骨炎癥痛和脛神經(jīng)

11、痛模型并通過(guò)比較其行為學(xué)差異
　　 (1)大鼠脛骨癌痛模型
　　 參照毛應(yīng)啟梁等報(bào)道的大鼠脛骨癌痛模型，采用微量進(jìn)樣器將 Walker256乳腺癌細(xì)胞注入大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)。隨著腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，大鼠后肢無(wú)明顯熱痛覺過(guò)敏，但是產(chǎn)生明顯的機(jī)械性痛覺超敏，與之前的報(bào)道表現(xiàn)一致，表明該模型建立成功。
　　 (2)大鼠脛骨炎癥痛模型
　　 與脛骨癌痛模型類似，采用微量進(jìn)樣器將金黃色葡萄球菌(S.aureus)注入大鼠

12、脛骨骨髓腔內(nèi)。隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，4天后模型大鼠脛骨骨髓腔內(nèi)產(chǎn)生急性炎癥，8天后發(fā)展為亞急性炎癥，12天后進(jìn)入慢性炎癥階段，16天后炎癥開始恢復(fù)。血常規(guī)結(jié)果表現(xiàn)出一致的變化，在第4天與第8天白細(xì)胞數(shù)量顯著增高，12天后與注射纖維蛋白膠對(duì)照組大鼠無(wú)顯著差異，血常規(guī)的其它指標(biāo)未發(fā)現(xiàn)顯著性改變。模型大鼠從術(shù)后2天開始產(chǎn)生明顯的機(jī)械性痛覺超敏和熱痛覺過(guò)敏。有趣的是模型大鼠雙后肢產(chǎn)生明顯的機(jī)械性痛覺超敏，但是只有患肢表現(xiàn)出顯著的熱痛覺過(guò)敏。此外，免疫

13、熒光結(jié)果顯示脊髓背角內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)顯著增加。表明該炎癥痛模型的建立是成功的、可靠的。
　　 (3)大鼠脛神經(jīng)痛模型
　　 參照Woolf等建立的SNI(spared nerve injury)神經(jīng)痛模型，我們?cè)诖酥唤Y(jié)扎大鼠的脛神經(jīng)，而保留腓腸神經(jīng)和腓總神經(jīng)的完整。從手術(shù)后第2天開始，大鼠手術(shù)側(cè)后肢表現(xiàn)出明顯的機(jī)械性痛覺超敏和熱痛覺過(guò)敏，一直到16天還保持穩(wěn)定的痛覺敏化狀態(tài)，表明該神經(jīng)痛模型是成功的。

14、>　　 (4)三種疼痛模型對(duì)塞來(lái)昔布的敏感性比較
　　 從術(shù)后第6天給予塞來(lái)昔布灌胃治療，持續(xù)到第10天，20mg/kg.day，早晚各一次。在術(shù)后第8天，血藥濃度穩(wěn)定后，觀察不同疼痛模型大鼠對(duì)塞來(lái)昔布的敏感性。結(jié)果顯示脛骨炎癥痛大鼠對(duì)塞來(lái)昔布有很好的敏感性，而脛骨癌痛與脛神經(jīng)痛大鼠對(duì)塞來(lái)昔布的敏感性比較弱。
　　 小結(jié)：通過(guò)本部分的研究，我們建立了大鼠脛骨炎癥痛、脛神經(jīng)痛模型作為大鼠脛骨癌痛模型的研究對(duì)照模型，并系統(tǒng)

15、的對(duì)比了三種模型機(jī)械性痛覺超敏、熱痛覺過(guò)敏等疼痛行為的差異，此外我們還比較了三種模型大鼠對(duì)抗炎鎮(zhèn)痛藥塞來(lái)昔布的敏感性。我們的結(jié)果提示，大鼠脛骨癌痛與脛骨炎癥痛、脛神經(jīng)痛行為上既有相似之處，又有不同的地方，提示了骨癌痛可能有神經(jīng)痛與炎癥痛兩種成份共同參與，但又有其獨(dú)特的機(jī)理。采用脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)模型作為對(duì)照模型研究脛骨癌痛的機(jī)理有重要的臨床意義，為深入開展大鼠脛骨癌痛的機(jī)理研究提供了有效的方法。
　　 2.觀察脊髓TLR9在三種

16、疼痛模型中的作用及其機(jī)制
　　 (1)通過(guò)RT-PCR的方法檢測(cè)TLR9 mRNA在三種模型上的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，手術(shù)后12天，與正常組大鼠相比，脛骨炎癥痛與脛骨癌痛大鼠脊髓內(nèi)TLR9mRNA的表達(dá)顯著升高，而脛神經(jīng)痛大鼠則無(wú)明顯的改變。各模型組大鼠手術(shù)同側(cè)和對(duì)側(cè)變化趨勢(shì)一致。
　　 (2)通過(guò)Western-Blot方法檢測(cè)TLR9蛋白在三種疼痛模型上的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，手術(shù)后12天，與各自模型對(duì)照組大鼠相比，脛骨

17、癌痛與脛骨炎癥痛大鼠脊髓背角內(nèi)TLR9的表達(dá)顯著升高，而脛神經(jīng)痛大鼠TLR9的表達(dá)未發(fā)生顯著性的改變。
　　 (3)為了明確脛骨癌痛時(shí)TLR9在脊髓背角內(nèi)的表達(dá)定位，我們采用免疫雙標(biāo)的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，TLR9與神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN存在大量共標(biāo)，但是與星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物CD11b幾乎無(wú)共存。表明在脛骨癌痛時(shí)，神經(jīng)元內(nèi)的TLR9大量表達(dá)。
　　 (4)為了觀察TLR9在疼痛中的作用，我們通過(guò)

18、鞘內(nèi)注射的方法給予三種模型大鼠TLR9的拮抗劑ODN2088，并觀察其對(duì)三種疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示，ODN2088在給藥后1小時(shí)與2小時(shí)均能顯著性提高脛骨癌痛、脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械性痛閾，4小時(shí)后作用消失。但是產(chǎn)生相同程度的鎮(zhèn)痛作用，脛骨癌痛大鼠所需要的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脛骨炎癥痛和脛神經(jīng)痛大鼠。
　　 (5)為了觀察TLR9的內(nèi)源性配體HSP90在疼痛中的作用，我們通過(guò)鞘內(nèi)注射的方法給予三種模型大鼠HSP90的抑

19、制劑17-DMAG，并觀察其對(duì)三種疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果顯示，17-DMAG在給藥后1小時(shí)與2小時(shí)均能顯著性提高脛骨癌痛、脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械性痛閾，4小時(shí)后作用消失。但是產(chǎn)生相同程度的鎮(zhèn)痛作用，脛骨癌痛大鼠所需要的劑量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于脛骨炎癥痛和脛神經(jīng)痛。
　　 (6)TLR9信號(hào)通路下游的細(xì)胞因子的表達(dá)變化
　　 為了觀察TLR9在疼痛中的作用機(jī)制，我們采用Bio-Plex懸液芯片法檢測(cè)了細(xì)胞因子IL-1β、

20、IL-4、IL-6、IL-10與TNF-α在三種疼痛模型中的表達(dá)變化以及ODN2088與17-DMAG對(duì)這些細(xì)胞因子的表達(dá)影響。結(jié)果顯示，脛骨癌痛大鼠脊髓內(nèi)IL-1β的表達(dá)顯著升高，鞘內(nèi)給予ODN2088與17-DMAG均能有效下調(diào)IL-1β的表達(dá)。脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)痛大鼠脊髓內(nèi)IL-1β沒(méi)有顯著變化。此外，IL-4、IL-6、IL-10與TNF-α在三種疼痛模型大鼠的表達(dá)均沒(méi)有發(fā)生顯著性改變。
　　 小結(jié)：綜上所述，造模12天

21、后，脛骨癌痛大鼠脊髓背角內(nèi)TLR9表達(dá)顯著升高，鞘內(nèi)給予TLR9的拮抗劑ODN2088能顯著性的提高脛骨癌痛大鼠機(jī)械性痛閾，鞘內(nèi)給予HSP90抑制劑17-DMAG對(duì)脛骨癌痛大鼠也有顯著的鎮(zhèn)痛作用。脛骨癌痛大鼠脊髓內(nèi)炎性細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)顯著升高，ODN2088與17-DMAG均能顯著性下調(diào)IL-1β的表達(dá)。雖然ODN2088與17-DMAG對(duì)脛骨炎癥痛與脛神經(jīng)痛大鼠也有明顯的鎮(zhèn)痛作用，但是我們所檢測(cè)的炎性細(xì)胞細(xì)胞因子在脛骨炎癥痛與脛

22、神經(jīng)痛中沒(méi)有發(fā)生顯著性改變，提示可能通過(guò)其它的機(jī)制發(fā)揮作用，有待進(jìn)一步的研究。綜上，這提示HSP90-TLR9-IL-1β信號(hào)通路可能是脛骨癌痛所特有的，對(duì)此信號(hào)通路進(jìn)行深入的研究有可能為臨床治療骨癌痛提供新的突破點(diǎn)。
　　 3.電針對(duì)模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用
　　 為了驗(yàn)證電針對(duì)不同疼痛模型大鼠的鎮(zhèn)痛作用，我們對(duì)三種模型大鼠分別給予多次電針治療，針刺穴位為“足三里”與“昆侖”，隔天檢測(cè)機(jī)械性痛閾，并進(jìn)一步觀察電針對(duì)TLR9表

23、達(dá)的影響。
　　 (1)電針對(duì)脛骨癌痛大鼠的作用
　　 結(jié)果顯示，給予脛骨癌痛大鼠多次電針治療，對(duì)其機(jī)械性痛閾沒(méi)有顯著性改變，對(duì)模型大鼠脊髓內(nèi)TLR9表達(dá)無(wú)明顯的改變。
　　 (2)電針對(duì)脛骨炎癥痛大鼠的作用
　　 結(jié)果顯示，給予脛骨炎癥痛大鼠多次電針治療，能顯著提高其機(jī)械性痛閾，并能顯著性降低模型大鼠脊髓內(nèi)TLR9的表達(dá)。
　　 (3)電針對(duì)脛神經(jīng)痛大鼠的作用
　　 結(jié)果顯示，給予脛神經(jīng)

24、痛模型大鼠多次電針治療，能顯著提高其機(jī)械性痛閾，但是對(duì)模型大鼠脊髓內(nèi)TLR9的表達(dá)無(wú)顯著性改變。
　　 小結(jié)：電針對(duì)脛骨癌痛大鼠TLR9的表達(dá)無(wú)顯著性改變，對(duì)其機(jī)械性痛閾也沒(méi)有顯著性的影響。而電針能顯著性下調(diào)脛骨炎癥痛大鼠TLR9的表達(dá)，并且能顯著性提高其機(jī)械性痛閾。電針對(duì)脛神經(jīng)痛大鼠TLR9的表達(dá)沒(méi)有明顯改變，但是能顯著提高脛神經(jīng)痛大鼠的機(jī)械性痛閾。由于脛神經(jīng)痛大鼠本身TLR9的表達(dá)不明顯，綜合之前的研究表明電針通過(guò)其它的機(jī)制

25、參與脛神經(jīng)痛的鎮(zhèn)痛。電針對(duì)脛骨癌痛與脛骨炎癥痛的作用表明，TLR9在針刺鎮(zhèn)痛中可能發(fā)揮著重要的作用。
　　 綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)大鼠脛骨癌痛、脛骨炎癥痛、脛神經(jīng)痛三種不同慢性痛的對(duì)比研究，表明脛骨癌痛與脛骨炎癥痛、神經(jīng)痛既有相似之處，又有其獨(dú)特性。
　　 1.在行為學(xué)表現(xiàn)方面，脛骨癌痛時(shí)機(jī)械性痛覺超敏顯著而熱痛覺過(guò)敏不顯著，提示癌痛有其獨(dú)特性。
　　 2.HSP90-TLR9-IL-1β信號(hào)通路在大鼠脛骨癌痛的