番石榴葉提取物輔助降血糖作用及其機(jī)制研究.pdf

1、近年來，全球糖尿病患病率呈逐年上升趨勢(shì)。2002年我國(guó)成人糖尿病患病率為2.6％，估計(jì)全國(guó)糖尿病現(xiàn)患人數(shù)2000多萬，到2025年將達(dá)到3800萬。糖尿病是一組因胰島素絕對(duì)或相對(duì)缺乏引起的以高血糖為特征的代謝性疾病。慢性高血糖產(chǎn)生葡萄糖毒性作用，與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因此，嚴(yán)格控制血糖，是糖尿病治療的基本要求，尋找方便易行、安全可靠的控制血糖方法，對(duì)糖尿病的預(yù)防和治療顯得十分重要。 番石榴葉具有輔助降血糖作用，其

2、作用機(jī)制和功效成分研究尚不廣泛深入。我國(guó)番石榴自然資源豐富，海南、廣東、廣西、臺(tái)灣、福建、云南、貴州和四川等省、自治區(qū)有引種種植或遺為野生的種類。四川攀枝花地區(qū)野生番石榴葉輔助降血糖作用未見研究報(bào)道。 本文研究攀枝花地區(qū)野生番石榴葉提取物輔助降血糖作用及其機(jī)制，為開發(fā)利用番石榴葉野生資源提供參考依據(jù)。 全文從以下三部分進(jìn)行研究： 1、番石榴葉提取物制備和及其輔助降血糖作用比較 目的：制備番石榴葉水提取物和

3、不同濃度乙醇提取物，比較不同提取物對(duì)糖尿病小鼠輔助降血糖作用，篩選安全、有效的降血糖提取物。 方法：采摘攀枝花地區(qū)野生番石榴葉，清洗、晾干、打碎，分別用蒸餾水、65％和95％食用乙醇浸提，浸提液過濾、濃縮、干燥(乙醇提取物用乙醚脫脂)后，研磨成粉得水提取物(WE)、65％乙醇提取物(AE65)和95％乙醇提取物(AE95)。選用雄性昆明種小鼠，鏈脲佐菌素(STZ)80mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病。WE、AE65和AE95懸液灌胃

4、4周，降血糖藥物格列吡嗪(Glipizide)作為降血糖效果陽性對(duì)照，比較三種提取物輔助降血糖效果，比較各組小鼠生長(zhǎng)情況。 結(jié)果： WE、AE65和AE95等三種提取物得率分別為14.5％、22.0％和11.0％。三種提取物均可明顯降低糖尿病小鼠禁食3h空腹血糖，在1.25g/kg劑量水平，AE95組小鼠血糖降低31.3％，降血糖程度明顯低于Glipizide組(43.2％)；WE和AE65組小鼠血糖分別降低36.3％和33.5

5、％，降血糖程度低于Glipizide，但三者差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；三種提取物中，WE對(duì)小鼠的體重影響較小。WE的1.25、2.5和5.0g/kg三個(gè)劑量中，低劑量和中劑量組小鼠血糖下降差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，對(duì)糖尿病小鼠體重增長(zhǎng)的影響與模型對(duì)照組和Glipizidc陽性對(duì)照組相似；高劑量WE組小鼠血糖降低45.4％，和Glipizide相近，但對(duì)小鼠體重增長(zhǎng)影響較大。 結(jié)論：番石榴葉水提取物、65％乙醇提取物和95％乙醇提取物均具有輔

6、助降血糖作用；水提取物安全性較高。 2、 番石榴葉水提取物輔助降血糖作用機(jī)制研究 2.1 番石榴葉水提取物對(duì)小腸粘膜α-葡萄糖苷酶活性的影響 目的：研究番石榴葉水提取物(WE)對(duì)小腸粘膜α-葡萄糖苷酶的抑制作用。 方法：選用雄性昆明種小鼠，STZ腹腔注射(80mg/kg)誘導(dǎo)糖尿病模型。以小鼠小腸粘膜生理鹽水勻漿液用作α-葡萄糖苷酶待測(cè)液，與雙糖底物孵育，比色法測(cè)定葡萄糖產(chǎn)量代表α-葡萄糖苷酶的活性。比較

7、正常對(duì)照組小鼠和糖尿病小鼠小腸粘膜α-葡萄糖苷酶活性，測(cè)定WE對(duì)糖尿病小鼠小腸粘膜α-葡萄糖苷酶活性的影響，Lineweaver-Burk作圖判斷WE對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制作用類型。 結(jié)果：WE對(duì)糖尿病小鼠小腸粘膜蔗糖酶和麥芽糖酶具有較強(qiáng)的抑制作用，并呈劑量效應(yīng)關(guān)系，抑制作用類型為部分競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性混合型。 結(jié)論：番石榴葉水提取物具有抑制糖尿病小鼠小腸α-葡萄糖苷酶作用，減緩腸道碳水化合物消化吸收可能是其輔助降血糖作用機(jī)

8、制之一。 2.2 番石榴葉水提取物對(duì)肝臟糖代謝的調(diào)節(jié)作用 目的：研究番石榴葉水提取物(WE)對(duì)糖尿病小鼠肝臟糖代謝的影響，探討輔助降血糖作用分子生物學(xué)機(jī)制。 方法：雄性昆明種小鼠，鏈脲佐菌素(STZ)80mg/kg腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病模型。實(shí)驗(yàn)小鼠分為正常對(duì)照組、糖尿病模型對(duì)照組和WE輔助降血糖組，WE按2.5g/kg劑量灌胃4W，葡萄糖溶液灌胃進(jìn)行口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，丙氨酸溶液腹腔注射進(jìn)行12h空腹糖

9、異生實(shí)驗(yàn)；小鼠脫頸椎處死，測(cè)定肝糖原含量，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)測(cè)定肝組織中葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸酶(G6pc)和肝糖原合酶(Gys-2)等糖代謝關(guān)鍵酶mRNA水平。 結(jié)果：與正常對(duì)照組小鼠相比，糖尿病模型對(duì)照組小鼠3h和12h空腹血糖(21.29和12.76mmol/L)明顯升高，口服葡萄糖耐量明顯減低(AUC=48.11)，丙氨酸注射1h和2h糖異生率明顯升高(36.5％和59.1％)

10、，肝糖原含量(3.01 mg/g)明顯減少。WE灌胃4周后，與糖尿病模型對(duì)照組小鼠相比，WE灌胃組小鼠3h和12h空腹血糖(14.09和8.04mmol/L)明顯降低，口服葡萄糖耐量明顯改善(AUC=36.81)，丙氨酸注射1h和2h糖異生率明顯降低(23.7％和38.5％)，肝糖原含量(3.87mg/g)明顯升高。糖尿病模型對(duì)照組小鼠肝組織中GK mRNA水平明顯下降，只是正常對(duì)照組小鼠的1.3％；G6pc mRNA水平明顯上升，達(dá)到

11、正常對(duì)照組小鼠的3.0倍； Gys-2 mRNA水平?jīng)]有明顯變化。WE灌胃處理，糖尿病小鼠肝GKmRNA水平明顯升高，是模型對(duì)照組小鼠的6倍；G60c mRNA水平呈下降趨勢(shì)，Gys-2 mRNA水平呈上升趨勢(shì)。 結(jié)論：番石榴葉水提取物可能通過調(diào)節(jié)糖尿病小鼠體內(nèi)肝臟糖代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)和改善胰島素分泌來提高組織對(duì)葡萄糖的吸收利用能力，促進(jìn)肝糖原合成，減少糖異生，從而起到輔助降血糖作用。 2.3 番石榴葉水提取物抗氧化和胰

12、島保護(hù)作用 目的：研究番石榴葉水提取物(WE)抗氧化作用，觀察WE對(duì)胰島保護(hù)和損傷修復(fù)作用，為WE減輕機(jī)體組織氧化損傷提供依據(jù)。 方法：體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定WE對(duì)羥自由基清除率和脂質(zhì)過氧化抑制率。WE對(duì)肝臟糖代謝的調(diào)節(jié)作用研究(2.2)中小鼠脫頸椎處死，取肝組織測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量；取胰腺常規(guī)HE染色和胰島素抗體免疫組化(HIC)染色，光學(xué)顯微鏡進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察和圖像

13、灰度分析，比較小鼠胰島組織病理學(xué)變化。 結(jié)果：WE具有清除羥自由基和抑制脂質(zhì)過氧化作用，呈劑量效應(yīng)關(guān)系。與正常對(duì)照組小鼠相比，糖尿病模型對(duì)照組小鼠肝組織SOD水平(163.46U/mg protein)和GSH水平(27.96mg/g protein)明顯下降，CAT水平(389.4U/g protein)呈下降趨勢(shì)；WE灌胃處理后，糖尿病小鼠抗氧化能力提高，肝組織GSH水平(32.79 mg/g protein)明顯升高，SO

14、D和CAT水平(199.23和411.7U/g protein)出現(xiàn)上升趨勢(shì)。糖尿病小鼠胰島出現(xiàn)明顯的病理損傷，胰島數(shù)量、密度、體積減少；胰島內(nèi)分泌細(xì)胞減少、細(xì)胞變性，胰島素陽性表達(dá)的β細(xì)胞減少，胰島素表達(dá)強(qiáng)度減弱。WE處理后，糖尿病小鼠胰島病理損傷減輕，胰島的數(shù)目和體積增加，表達(dá)胰島素的β細(xì)胞數(shù)量增加，β細(xì)胞胰島素表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng)。 結(jié)論：番石榴葉水提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，通過保護(hù)糖尿病小鼠胰島、減輕β細(xì)胞氧化損傷，恢復(fù)和改善

15、β細(xì)胞合成分泌胰島素功能，可能是番石榴葉水提取物輔助降血糖作用機(jī)制之一。 3、番石榴葉提取物中輔助降血糖功效成分初步分析 目的：初步探討番石榴葉提取物輔助降血糖功效成分。 方法：紫外分光光度法分析番石榴葉水提取物(WE)、65％乙醇提取物(AE65)和95％乙醇提取物(AE95)中總黃酮含量，高效液相色譜(HPLC)和紫外可見吸收光譜法(UV)對(duì)黃酮類化合物初步鑒定；電感耦合等離子體一原子發(fā)射光譜法(ICP)測(cè)定

16、提取物中Mg、Cr、V等礦物質(zhì)含量。比較分析番石榴葉提取物中各成分含量與輔助降血糖效果之間關(guān)系。 結(jié)果：番石榴葉提取物主要含有槲皮素為苷元的黃酮類化合物，WE、AE65和AE95三種提取物總黃酮含量分別為3.28、30.71和55.98g/kg;WE中Mg、Cr、V等礦物質(zhì)含量均比較高(分別為9259.08、11.41和49.54 mg/kg)，AE65中三種礦物質(zhì)較少，AE95中三種礦物質(zhì)含量最低。 結(jié)論：番石榴葉提取