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文檔簡介
1、 本文通過構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白報告基因的哺乳動物shRNA表達載體和HBeAg真核表達載體,兩者共轉(zhuǎn)染Hela細胞,探討shRNA表達載體對HBeAg表達的抑制作用,為應用RNAi技術治療乙型肝炎奠定一定的理論基礎。方法:本研究首先采用PCR方法從含有人U6啟動子的載體PTZU6+1中擴增U6啟動子,將其克隆到pEGFP-C1載體中,通過限制性內(nèi)切酶、PCR及測序?qū)?gòu)建的載體進行鑒定,并轉(zhuǎn)染Hela細胞,觀察綠色熒光蛋白的表達;然
2、后構(gòu)建HBeAg表達載體,通過酶切、PCR及測序鑒定,把質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細胞,用RT-PCR檢測mRNA的轉(zhuǎn)錄,免疫細胞化學檢測HBeAg前體的表達,ELISA和MEIA分別檢測細胞裂解液HBeAg前體和培養(yǎng)上清HBeAg的表達;把構(gòu)建的兩載體按7:1的比例共轉(zhuǎn)染Hela細胞,用半定量PCR和MEIA分析shRNA表達載體對HBeAgmRMA和蛋白質(zhì)的抑制情況;研究表明:成功構(gòu)建了帶有綠色熒光蛋白報告基因的哺乳動物shRNA表達載體和乙
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