RNA干擾技術(shù)抑制SKOV3細(xì)胞EGFR表達(dá)的研究.pdf

1、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）在約50％以上的卵巢癌中表達(dá)水平升高，與腫瘤的增生和轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，是極具潛力的基因治療靶點(diǎn)[1]。 RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）介導(dǎo)的，序列特異的基因沉默現(xiàn)象。通過長度為21～23個核苷酸(nucleotide，nt)的雙鏈小干擾RNA（sm

2、all interfering RNA，siRNA）與細(xì)胞內(nèi)相對應(yīng)的mRNA結(jié)合，激活內(nèi)源性RNA內(nèi)切酶，特異性降解mRNA，從而抑制蛋白表達(dá)。RNA干擾技術(shù)能特異、高效、快速地抑制靶基因的表達(dá)，已廣泛應(yīng)用于基因治療的研究[2-3]。 目前，應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制卵巢癌EGFR表達(dá)方面的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本課題通過化學(xué)合成的siRNA抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞EGFR的表達(dá)，探討其生物學(xué)特性的改變，為卵巢癌基因治療提供一定

3、的理論依據(jù)。 本課題共分三個部分：①RNAi技術(shù)抑制人卵巢癌細(xì)胞株EGFR表達(dá)；②干擾EGFR基因表達(dá)對SKOV3細(xì)胞增殖力的影響；③干擾EGFR基因表達(dá)對SKOV3細(xì)胞粘附、移行和侵襲行為的影響。 第一部分 RNAi技術(shù)抑制人卵巢癌細(xì)胞株EGFR表達(dá) 目的：探討采用化學(xué)合成小干擾RNA（siRNA)介導(dǎo)的RNA干擾(RNAi)技術(shù)是否能有效抑制人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3細(xì)胞EGFR表達(dá)。 方法：(1)測定

4、SKOV3細(xì)胞株EGFR的表達(dá)。(2)體外化學(xué)合成EGFR序列特異性雙鏈RNA（dsRNA-EGFR)，與Lipofectamine 2000結(jié)合后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，采用RT－PCR和Western blot技術(shù)檢測EGFR mRNA和蛋白水平的變化，觀察dsRNA-EGFR/Lipofectamine 2000對EGFR表達(dá)的抑制作用。 結(jié)果：SKOV3細(xì)胞株存在EGFR表達(dá)。dsRNA-EGFR/Lipofectamine 2000

5、復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞可引發(fā)EGFR序列特異性基因沉默效應(yīng)，序列特異性dsRNA-EGFR對SKOV3細(xì)胞EGFR mRNA和蛋白的抑制率分別為73.65％和58.94％。與對照組比較，dsRNA-EGFR組細(xì)胞EGFR mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論：(1）SKOV3細(xì)胞株存在EGFR表達(dá)。(2）dsRNA-EGFR序列可特異性下調(diào)SKOV3細(xì)胞EGFR基因水平，顯著降低EGFR蛋白表達(dá)。

6、 第二部分干擾EGFR基因表達(dá)對SKOV3細(xì)胞增殖能力的影響 目的：探討應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制EGFR基因表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞株SKOV3增殖能力的影響。 方法：應(yīng)用水溶性四唑鹽(WST-1)比色法檢測dsRNA-EGFR下調(diào)EGFR基因表達(dá)后SKOV3細(xì)胞增殖力的變化。 結(jié)果：dsRNA-EGFR組在轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h細(xì)胞增殖抑制率分別為22.54％、35.76％和31.07％，細(xì)胞增殖率明顯下降，與

7、對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。 結(jié)論：RNAi抑制EGFR的表達(dá)可以有效抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖能力。 第三部分干擾EGFR基因表達(dá)對SKOV3細(xì)胞粘附、移行和侵襲行為的影響 目的：探討應(yīng)用RNAi技術(shù)抑制EGFR基因表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞株SKOV3粘附、移動和侵襲力的影響。 方法：采用細(xì)胞粘附和移動實(shí)驗(yàn)檢測dsRNA-EGFR下調(diào)EGFR基因表達(dá)后SKOV3細(xì)胞體外粘附和移動能力的變化，通過細(xì)

8、胞侵襲重建基底膜實(shí)驗(yàn)檢測SKOV3細(xì)胞體外侵襲能力的改變。 結(jié)果：dsRNA-EGFR組30min和90min時的粘附抑制率分別為12.11％和18.66％，均高于對照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；轉(zhuǎn)染dsRNA-EGFR后細(xì)胞體外移動和侵襲能力的抑制率分別為25.47％和22.08％，分別與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論：RNAi抑制EGFR的表達(dá)可以有效抑制卵巢癌細(xì)胞的移動、粘附