RNA干擾抑制HBV蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制的研究.pdf

1、本論文利用RNAi技術(shù)進(jìn)行了抗HBV的研究.利用RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子U6構(gòu)建了shRNA表達(dá)載體pU6P:在HBV基因組上選擇了包含所有編碼框在內(nèi)的12個(gè)干擾靶點(diǎn),構(gòu)建針對(duì)HBV的shRNA表達(dá)載體pU6-siHBV;pU6-siHBV轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞,通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液內(nèi)HBV抗原含量,發(fā)現(xiàn)12個(gè)質(zhì)粒中的5個(gè)對(duì)HBsAg的表達(dá)有明顯的抑制作用,最高達(dá)72.8±5.4﹪;對(duì)HBeAg的抑制率最高為55.8±6.2﹪.定量PCR結(jié)果顯示,

2、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)液中HBV DNA的含量下降了1.9倍.細(xì)胞同時(shí)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照質(zhì)粒pU6-siGFP,對(duì)HBV蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制沒(méi)有影響,說(shuō)明RNAi作用具有序列特異性.利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染篩選得到的有效靶點(diǎn)構(gòu)建含有puromycin篩選標(biāo)記的shRNA表達(dá)載體pGK-siHBV,轉(zhuǎn)染2.2.15細(xì)胞后,經(jīng)puromycin篩選得到穩(wěn)定抑制HBV蛋白表達(dá)的細(xì)胞株,用PCR和測(cè)序證實(shí)其基因組確實(shí)整合了轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的序列.對(duì)穩(wěn)定株的鑒定實(shí)驗(yàn)表明,與2.2.

3、15細(xì)胞相比,穩(wěn)定株對(duì)培養(yǎng)上清中HBsAg的抑制率達(dá)95﹪左右,對(duì)HBeAg的抑制率在80﹪以上;而細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示,在穩(wěn)定株細(xì)胞中幾乎找不到HBsAg或HBcAg陽(yáng)性細(xì)胞.說(shuō)明shRNA的持續(xù)表達(dá)對(duì)HBV蛋白表達(dá)的抑制非常明顯,Northern Blot和Western Blot的結(jié)果也支持這一觀點(diǎn).穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株比2.2.15細(xì)胞HBV DNA含量降低10倍.經(jīng)空載體pU6P穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株對(duì)HBV的蛋白表達(dá)和復(fù)制沒(méi)有影響,說(shuō)明

4、抑制效果確實(shí)是由RNAi作用引起的.為驗(yàn)證在動(dòng)物水平RNAi的抗病毒作用,將pU6-siHBV質(zhì)粒用hydrodynamics的方法經(jīng)尾靜脈注射到HBV轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi),注射后小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶有一過(guò)性升高,但很快恢復(fù)正常,肝臟切片沒(méi)有明顯的病理性改變,說(shuō)明這種注射方法是安全的.質(zhì)粒注射后5天,血清HBsAg下降了56.7﹪,抑制作用至少持續(xù)2周.肝臟免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示HBcAg陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少,說(shuō)明RNAi能有效抑制轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)HBV的

5、蛋白質(zhì)表達(dá).但HBV DNA定量沒(méi)有明顯的降低.除上述質(zhì)粒介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)外,還用化學(xué)合成的siRNA進(jìn)行了細(xì)胞實(shí)驗(yàn).結(jié)果顯示siRNA最佳的作用濃度是100nM,轉(zhuǎn)染后3天抑制率最高.蛋白質(zhì)和mRNA水平的檢測(cè)都證實(shí)siRNA能有效并且特異地抑制HBV蛋白質(zhì)的表達(dá).總之,本論文從細(xì)胞到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證明RNAi能有效抑制HBV的蛋白表達(dá)和病毒復(fù)制,為其用于乙型肝炎的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù).尤其是穩(wěn)定細(xì)胞株的建立,不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)HBV蛋白表達(dá)和病毒