鼠傷寒沙門菌乙?；孜锏暮Y選及Lrp乙?；揎椪{節(jié)其功能的研究.pdf

1、蛋白質翻譯后修飾包括磷酸化、糖基化、泛素化和乙?；?。蛋白質乙?；揎椫饕l(fā)生在賴氨酸殘基上，是一種重要的蛋白質翻譯后修飾。從1964年首次發(fā)現(xiàn)乙酰化修飾以來，在真核生物和原核生物中越來越多的乙酰化蛋白被鑒定到，并且發(fā)現(xiàn)乙酰化參與轉錄調節(jié)，細胞代謝等一系列生命活動。
　　原核生物的乙酰化研究主要集中在大腸桿菌和沙門菌，通過抗體免疫富集技術結合高分辨率質譜技術，鑒定到了非常多的乙?；鞍住Ｔ谏抽T菌細胞內已發(fā)現(xiàn)CobB和Pat分別行使

2、蛋白質去乙酰化和乙?；饔谩４送?，細胞代謝物乙酰磷酸(AcP)也可以化學催化方式對蛋白質進行乙酰化修飾，但對底物缺乏專一性。因此，我們希望通過細菌雙雜交的方式篩選直接與CobB和Pat相互作用的蛋白，以發(fā)現(xiàn)更多的乙?；揎椀鞍?。
　　本研究首先構建了鼠傷寒沙門菌(Salmonella enerica serovar Typhimurium)的基因組DNA文庫，然后用細菌雙雜交系統(tǒng)，在報告菌株中共轉化文庫質粒和pUT18-pat或p

3、UT18-cobB，利用藍白選擇篩選與Pat和CobB相互作用的蛋白，然后用Western blot檢測篩選到蛋白的乙?；揭约笆欠袷躊at/CobB/AcP的調控。
　　實驗結果顯示，通過細菌雙雜交篩選，我們獲得了12個與CobB或Pat有相互作用的蛋白。隨后驗證了5個蛋白(Lrp、NrdF、RhaR、1074、FliT)，發(fā)現(xiàn)除FliT外，其他4個蛋白均存在乙?；揎?。有意思的是這4個蛋白顯示不同的Pat/CobB/AcP乙

4、?；揎棛C制。其中Lrp(leucine-responsive protein)是沙門菌的全局性轉錄調節(jié)因子，能夠正向調控或負向調控很多基因和操縱子的表達，包括參與氨基酸的代謝和轉運，菌毛的合成以及沙門菌的毒力等。
　　為進一步對Lrp的乙?；揎椆δ苓M行深入研究，我們將Lrp N端HTH結構域“識別螺旋”上的K36突變?yōu)镼（模擬乙?；嚢彼幔┗騌（模擬去乙?；嚢彼幔?，表達純化后用EMSA(凝膠遷移實驗)檢測突變體與受Lrp調節(jié)

5、的fimZ基因啟動子的結合能力。之后通過在△lrp中回補Lrp的野生型和36位賴氨酸模擬乙酰化的突變體，并用qPCR檢測下游基因的表達。Western blot顯示Lrp K36受到Pat和AcP的乙?；揎?。EMSA結果表明Lrp的K36突變后對fimZ啟動子的結合能力降低?；匮a實驗表明，Lrp K36模擬乙?；种葡掠位虻谋磉_。
　　綜上所述，我們在鼠傷寒沙門菌中共鑒定到12個直接與Pat或CobB有相互作用的蛋白，Lrp的