造血干細(xì)胞移植對(duì)受鼠內(nèi)皮損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討造血干細(xì)胞移植中引起內(nèi)皮損傷的因素及損傷的時(shí)限，同時(shí)觀察損傷對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的動(dòng)員作用。 方法: 1.單預(yù)處理手段對(duì)內(nèi)皮損傷近交系6-8周BALB/c(H-2Kd)小鼠給予環(huán)磷酰胺(MTX)、白消胺(Bu)、致死量照射及減低劑量照射等處理。小鼠隨機(jī)分5組，即：1) 正常對(duì)照組腹腔注射PBS；2) 環(huán)磷酰胺(CTX)組腹腔注射環(huán)磷酰胺稀釋液(60mg/kg.d-1 1d，2d)；3) 白消胺(Bu)組灌胃給予白消胺稀

2、釋液(4mg/kg.d-1 1d～4d)；4) 致死量照射組給予8.5Gy單次全身照射；5) 減低劑量照射組給予5.0 Gy單次全身照射。分別于第d1，d3，d5…d15取尾靜脈血，流式細(xì)胞儀檢測(cè)循環(huán)血液中內(nèi)皮細(xì)胞(CD31+ CD133- CD45-)及內(nèi)皮祖細(xì)胞(CD31+ CD133+ CD45-)比例；于d1，d3，d5…d15天，處死小鼠，取組織標(biāo)本，普通光學(xué)顯微鏡觀察HE染色后肝、小腸、皮膚的組織變化；透射電子顯微鏡分析肝、

3、小腸、皮膚內(nèi)皮組織的超微結(jié)構(gòu)變化。 2.移植損傷以近交系6-8周C57BL/6(H-2Kb)小鼠為供鼠、近交系6-8周BALB/c(c(H-2Kd)小鼠為受鼠，小鼠隨機(jī)分3組：1) 正常對(duì)照組給予尾靜脈注射PBS；2) 致死量照射組給予單次8.5Gy照射；3)骨髓移植(BMT)組給予8.5 Gy單次全身照射后行造血干細(xì)胞移植(骨髓單個(gè)核細(xì)胞2×107/只+脾淋巴細(xì)胞2×107/只)。分別于第d1，d3，d5…取尾靜脈血，流式細(xì)胞

4、儀檢測(cè)循環(huán)血液中內(nèi)皮細(xì)胞(CD31+ CD133- CD45-)及內(nèi)皮祖細(xì)胞(CD31+CD133+ CD45-)比例；移植組并檢測(cè)供者來(lái)源內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞和T細(xì)胞比例。移植后1d開(kāi)始，處死小鼠，取組織標(biāo)本，普通光學(xué)顯微鏡觀察HE染色后肝、小腸、皮膚的組織變化；透射電子顯微鏡分析肝、小腸、皮膚內(nèi)皮組織的超微結(jié)構(gòu)變化。 結(jié)果: 1.單預(yù)處理手段對(duì)內(nèi)皮損傷 1) CTX處理后，小鼠循環(huán)血白細(xì)胞于第3天降到最低，為(2.0

5、7±0.23)×109/L，隨后漸恢復(fù)到正常水平，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在白細(xì)胞降到最低時(shí)，循環(huán)血中內(nèi)皮細(xì)胞(EC)開(kāi)始增加，第5天達(dá)高峰，最高約為對(duì)照組2.7倍(p<0.05)，內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)則在第一天就開(kāi)始增加，也在第5天達(dá)高峰，最高約為對(duì)照組的3倍(p<0.05)；于外周血EC和EPC升到最高時(shí)，病理檢測(cè)小鼠組織臟器及相應(yīng)組織的超微結(jié)構(gòu)變化。HE染色，光鏡下可見(jiàn)，肝臟中央靜脈血栓形成，相應(yīng)小葉發(fā)生凝固性壞死；小腸見(jiàn)廣泛的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。電鏡

6、下，肝竇內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)見(jiàn)EC界限清楚，胞漿極少，未見(jiàn)細(xì)胞器，核膜完整，核染色質(zhì)邊集；2) Bu組，小鼠循環(huán)血白細(xì)胞于第3天開(kāi)始降低，第11天最低，最低為(0.9±0.17)×109/L；循環(huán)血中第1天EC最高，最高約為對(duì)照組1.5倍(p<0.05)，持續(xù)時(shí)間短，但EPC增加較為為明顯，于7天時(shí)候開(kāi)始增高，第11天最高約為對(duì)照組13.8倍(p<0.05)，取第7天小鼠組織病理觀察可見(jiàn)，肝臟和小腸中廣泛的實(shí)質(zhì)細(xì)胞水腫，局部炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；肝

7、竇內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)可見(jiàn)，EC邊界清楚，線粒體輕度水腫，核膜完整，染色質(zhì)稍凝集；3) 致死量照射后第3天，循環(huán)血中白細(xì)胞<0.5x109/L，后繼續(xù)減少，第9天小鼠全部死亡；同時(shí)，在第3天，外周血中EC增加，第5天達(dá)高峰，為對(duì)照組6.44倍(p<0.05)，持續(xù)到第7天，而EPC在3天開(kāi)始增加，于第5天達(dá)高峰，約為對(duì)照組24倍(p<0.05)，第5天肝臟的病理發(fā)現(xiàn)廣泛的實(shí)質(zhì)細(xì)胞水腫，匯管區(qū)可見(jiàn)少量淋巴系把浸潤(rùn)，超微結(jié)構(gòu)見(jiàn)內(nèi)皮細(xì)胞核碎裂、染

8、色質(zhì)邊集、內(nèi)皮完整性破壞；4) 減低劑量照射后，循環(huán)血中白細(xì)胞第3天開(kāi)始減少，第7天降至最低，最低達(dá)(0.8±0.15)×109/L，后漸回升的到正常。循環(huán)血中EC則在第5天開(kāi)始增加，第7天達(dá)高峰，最高約為對(duì)照組3.5倍(p<0.05)，至第9天降到正常水平；而EPC增加則較早，第1天達(dá)最高，約為對(duì)照組7.4倍(p<0.05)，約持續(xù)8天，但總增加幅度較致死量低。取第5天小鼠肝臟觀察發(fā)現(xiàn)，廣泛的實(shí)質(zhì)細(xì)胞輕度水腫，匯管區(qū)可見(jiàn)少量淋巴系把浸

9、潤(rùn)，超微結(jié)構(gòu)示內(nèi)皮細(xì)胞損傷較輕，主要見(jiàn)染色質(zhì)邊集。 2.移植損傷BMT組移植后第9天循環(huán)血白細(xì)胞>0.5x109/L，供鼠來(lái)源淋巴細(xì)胞于第9天占(2.13±0.01)％；至第11天，占T細(xì)胞總量的(3.97±0.42)％；與單純照射組相比，EC則出現(xiàn)兩次高峰，第一次出現(xiàn)在第3天，第5天達(dá)高峰，約為對(duì)照組4倍(p<0.05)，持續(xù)2天后下降；第2次出現(xiàn)在第8天，第9天達(dá)高峰，最高時(shí)約為對(duì)照組43.6倍(p<0.05)，約持續(xù)3天。

10、第9天的EC中，約22％來(lái)源于供鼠，大部分為受鼠來(lái)源。EPC也在第3天開(kāi)始增加，至第9天達(dá)最高，約為正常對(duì)照組的85.5倍(p<0.05)，第1天的EPC中，供鼠來(lái)源的EPC(allo-EPC)約占7％，后漸增多，在第11天時(shí)增加至94％，第9天病理檢測(cè)可見(jiàn)，肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞輕度水腫，匯管區(qū)可見(jiàn)大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，超微結(jié)構(gòu)內(nèi)皮細(xì)胞核碎裂，血管壁完整性破壞。 結(jié)論: 1.在我們的實(shí)驗(yàn)中示：TBI，CTX，Bu均可造成早期內(nèi)皮的損傷