耐藥念珠菌MDR1基因的表達(dá)與菌株生長(zhǎng)特性和對(duì)小鼠毒力的相關(guān)性.pdf

1、[目的]
　　許多念珠菌在臨床上成為耐藥念珠菌，這些耐藥念珠菌是否也會(huì)改變其毒力，使其成為超級(jí)菌危害人類健康是值得關(guān)注的重要問題。MDR1基因是與白念珠菌耐藥有關(guān)的基因之一，該基因表達(dá)量的差異是否會(huì)引起菌株生長(zhǎng)特性變化和白念珠菌在體內(nèi)感染毒力的變化尚無報(bào)道。為此，我們將利用三株MDR1基因表達(dá)量不同的白念珠菌研究該基因的表達(dá)量對(duì)白色念珠菌生長(zhǎng)特性的影響;通過菌體感染免疫抑制小鼠，研究MDR1基因的表達(dá)量與耐藥白色念珠菌對(duì)小鼠毒力之

2、間的相關(guān)性，同時(shí)檢測(cè)感染小鼠的免疫細(xì)胞因子變化，探討白念珠菌的耐藥、毒力和機(jī)體免疫之間的關(guān)系。為耐藥菌株的致病機(jī)理研究、臨床用藥、新藥的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。
　　[方法]
　　1.耐藥念珠菌MDR1基因的表達(dá)與菌株生長(zhǎng)特性的相關(guān)性
　　分別測(cè)定MDR1基因表達(dá)量不同的白色念珠菌CaR，CaDel，CaM的體外生長(zhǎng)速率、菌絲相細(xì)胞形成率和芽管生成情況。
　　2.耐藥念珠菌MDR1基因的表達(dá)與其對(duì)小鼠毒力的相關(guān)性

3、>　　通過腹腔注射環(huán)磷酰胺(CY)使ICR小鼠獲得免疫抑制，尾靜脈接種CaR、CaM、CaDel菌株。觀察感染后14天內(nèi)各組小鼠的臨床癥狀及生存變化;測(cè)定感染后2d、4d、6d、8d、10d各組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦的載菌量;HE、PAS染色觀察感染后2d、6d、14d各組小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦的病理變化;測(cè)定各組小鼠腎臟中IL-1β、TNF-α、IL-12p70、GM-CSF、IL-4、IL-10、IL-6和IFN-γ的水平。

4、
　　[結(jié)果]
　　1.耐藥念珠菌MDR1基因的表達(dá)與菌株生長(zhǎng)特性的相關(guān)性
　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:培養(yǎng)14h后3株菌的生長(zhǎng)速率出現(xiàn)差異，表現(xiàn)為CaR＞CaM＞CaDel，培養(yǎng)22h后3株菌逐漸到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期;體外誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中3株菌都不斷長(zhǎng)出新芽管，培養(yǎng)4h后3株菌均有90％以上的酵母相轉(zhuǎn)化為菌絲相，而且CaR與CaM、CaDel有顯著差異(P＜0.01)，CaM與CaDel之間無差異。
　　2.耐藥念珠菌MDR

5、1基因的表達(dá)與其對(duì)小鼠毒力的相關(guān)性
　　(1)感染小鼠死亡率變化。3組小鼠在染菌后均出現(xiàn)臨床癥狀，甚至死亡，而且CaR組的小鼠明顯比其它組表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床癥狀。感染后14天內(nèi)，CaR組小鼠死亡率達(dá)73％，CaM組小鼠未出現(xiàn)死亡，CaDel組小鼠死亡率為12.5％。CaR組小鼠死亡結(jié)果與CaM、CaDel組比較均有顯著差異(P＜0.01)，CaM與CaDel組死亡結(jié)果比較未見明顯差異。
　　(2)各組織載菌量變化。CaR、C

6、aM、CaDel感染小鼠，在染菌后10天內(nèi)心、肝、脾、肺、腎、腦各個(gè)臟器中均檢測(cè)到了菌體，而且各組動(dòng)物的各組織載菌量大多隨著時(shí)間的推移顯示下降趨勢(shì)。腦、脾、肝組織感染早期（2天～6天）載菌量出現(xiàn)一過性上升，隨后下降。載菌量從高到低分布:腎＞腦＞心＞肺＞脾＞肝。各感染組的組織載菌量的變化主要顯示在感染的早期，感染第8天后各感染組之間未見明顯差異。感染早期CaR組小鼠的心、脾、肝、肺的載菌量均比CaM、CaDel組高，其中心和脾的載菌量變化

7、出現(xiàn)顯著差異（P＜0.01）;腎和腦組織的載菌量在各感染時(shí)間點(diǎn)上各感染組之間未見顯著差異。CaM和CaDel各組織的載菌量在各感染時(shí)間點(diǎn)上也未見顯著差異
　　(3)組織病理變化。白色念珠菌感染免疫抑制小鼠顯示彌散性感染特征，心、肝、脾、肺、腎、腦各組織都受到損傷，真菌浸潤(rùn)。其中腎、腦組織的損傷最為嚴(yán)重。組織病理學(xué)上主要表現(xiàn)出以酵母型或菌絲型白念珠菌浸潤(rùn)，伴隨中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)形成彌漫性真菌性膿腫為主的的典型

8、變化。感染第2天，病灶構(gòu)成以菌絲型和酵母型真菌為主，病灶處組織出現(xiàn)變性、壞死，但未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);感染第6天，病灶構(gòu)成以酵母型真菌為主，菌絲型真菌減少，病灶處組織變性、壞死，病灶周圍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);感染第14天，病灶數(shù)量減少，體積縮小，真菌在臟器中的分布大大減少，而以炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)增生病變?yōu)橹?，在臟器中形成肉芽腫或增生病灶。
　　三組相比較，CaR組病灶分布更為廣泛，除腎臟、心臟和腦外，脾臟和肺臟均有不同程度真菌浸潤(rùn);并且感

9、染第2天，CaR組心臟的真菌浸潤(rùn)病灶數(shù)量明顯超過CaM組和CaDel組，病灶內(nèi)菌體形態(tài)，CaR組主要表現(xiàn)為菌絲型和酵母型真菌為主，CaM和CaDel組以酵母型為主。
　　(4)腎組織細(xì)胞因子分泌變化。腎組織細(xì)胞因子顯示耐藥念珠菌急性感染過程中，促炎因子大量增生。
　　感染第2天，CaR組腎組織細(xì)胞因子IL-12p70、GM-CSF、IL-4、IL-10未見升高，其它細(xì)胞因子明顯升高;而CaM組和CaDel組8種被檢因子均明顯

10、升高。而且，CaM組和CaDel組的IL-1β、IL-4、IL-10、TNF-α和、IL-12p70、GM-CSF均明顯高于CaR組，具有顯著性差異(P＜0.01);而CaM組與CaDel組之間比較未見差異;但是，3個(gè)感染組的IL-6和IFN-γ量比較未見明顯差異。
　　感染第4天，各組的細(xì)胞因子都出現(xiàn)下降。CaM組小鼠腎中IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12p70、TNF-α、GM-CSF、IL-6和IFN-γ的含量均高

11、于CaR組和CaDel組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。CaR組與CaDel組之間細(xì)胞因子量之間未見明顯差異。
　　感染第6天后，3組小鼠的腎組織細(xì)胞因子變化趨于穩(wěn)定，3組比較未見明顯差異。
　　[結(jié)論]
　　1.耐藥白色念珠菌MDR1基因表達(dá)量的高低，影響了菌株的生長(zhǎng)和菌絲形成速度，但并不抑制菌絲的生成。且隨其MDR1表達(dá)量升高菌株的生長(zhǎng)速率加快，菌絲相轉(zhuǎn)變加快，芽管的生成速度增加。
　　2.耐藥白色念珠菌M

12、DR1基因表達(dá)量的高低，影響了菌株對(duì)小鼠的毒力。CaR、CaM、CaDel都能損傷小鼠的組織器官，引起小鼠發(fā)病甚至死亡。MDR1基因表達(dá)量高的菌株CaR對(duì)小鼠的毒力增強(qiáng)，死亡率增高;MDR1基因低表達(dá)量的CaM、CaDel菌株對(duì)小鼠的毒力減弱，死亡率降低，與CaR相比較具有顯著性差異。結(jié)合組織載菌量檢測(cè)，CaR組心、脾的載菌量增加，與CaM、CaDel組比較，具有顯著差異。然而，念珠菌感染嚴(yán)重的腎、腦，載菌量絕對(duì)數(shù)量較高，各組之間卻沒有

13、明顯差異，感染小鼠的死亡與心、脾的載菌量變化密切相關(guān)，與腎、腦的相關(guān)性不大。組織病理診斷上也顯示，感染早期，CaR菌株對(duì)心組織損傷程度較大，病灶中顯示菌絲型菌與酵母型菌共存，然而，CaM、CaDel的病灶主要以酵母型菌為主。病灶中菌絲體的增多，體現(xiàn)了念珠菌對(duì)小鼠毒力的增強(qiáng)。
　　3.耐藥白色念珠菌MDR1基因表達(dá)量的高低，影響了小鼠感染后細(xì)胞因子水平。3株菌CaR、CaM、CaDel感染小鼠細(xì)胞因子的變化主要顯示在感染的第2天，C

14、aR的IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-6上升，其他因子IL-12p70、GM-CSF、IL-4和IL-10下降，而CaM和CaDel組的細(xì)胞因子水平均顯示顯著上升;感染第4天后逐漸下降;感染第6天后恢復(fù)到穩(wěn)定狀態(tài)。結(jié)合感染的死亡率，感染第2天，MDR1基因高表達(dá)的CaR組，促炎因子IL-1β和TNF-α上升程度明顯比CaM和CaDel組低;而且促炎因子IL-12p70和GM-CSF的分泌受到抑制，不能有效發(fā)揮早期抗感染作用;以