體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中白念珠菌表型和基因表達(dá)變化的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開(kāi)論述：
　　第一章 體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中白念珠菌表型變化的研究
　　目的:初步探索白念珠菌在體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中出現(xiàn)的表型改變。方法:選用6株同一來(lái)源的在體內(nèi)氟康唑長(zhǎng)期作用下耐藥性逐漸增強(qiáng)的一組白念珠菌（編號(hào)分別為Ca1、2、5、8、14、17，其中Ca1為用藥前），進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究、菌絲形成實(shí)驗(yàn)、表面疏水性(CSH)實(shí)驗(yàn)以及絮凝實(shí)驗(yàn)，探索白念珠菌在體內(nèi)獲得性耐藥這一過(guò)程中形態(tài)結(jié)構(gòu)、菌絲形成能力、黏附

2、性的變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)菌株的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞間的黏附能力未見(jiàn)明顯改變。除Ca17外，Ca2、5、8、14的菌絲形成率和CSH值都明顯比用藥前的敏感株Ca1高。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)菌株的菌絲形成能力、與宿主或非生命基質(zhì)間的黏附能力在獲得性耐藥的過(guò)程中發(fā)生了相應(yīng)的變化，這種改變的確切機(jī)制和意義尚有待進(jìn)一步研究。
　　第二章 體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中白念珠菌生物膜形成能力及其藥物敏感性變化的研究
　　第一節(jié) 體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中白念珠菌生物

3、膜形成能力的研究
　　目的:對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行生物膜構(gòu)建及結(jié)構(gòu)觀察，并比較在體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中各菌株生物膜形成能力的差異。方法:用24孔組織培養(yǎng)板構(gòu)建第一章所用6株菌的生物膜，在不同的培養(yǎng)時(shí)間(2、4、8、12、24h)置于倒置顯微鏡下對(duì)生物膜的形成過(guò)程進(jìn)行觀察;生物膜成熟后，用共聚焦激光掃描顯微鏡觀察比較各菌株生物膜形成情況;用甲基四氮鹽(XTT)減低法評(píng)價(jià)生物膜生長(zhǎng)過(guò)程中活力的變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)菌株的生物膜形成能力存在差異，根據(jù)生

4、物膜形成能力的不同，可將實(shí)驗(yàn)菌株分為:形成能力弱（用藥前的敏感株和用藥后耐藥程度最高的菌株）和形成能力強(qiáng)（兩者之間的4株菌，可理解為敏感和高度穩(wěn)定耐藥之間的過(guò)渡狀態(tài)）兩組。結(jié)論:在獲得性耐藥這一進(jìn)程中菌株的生物膜形成能力會(huì)發(fā)生改變，這種變化可能在對(duì)抗藥物選擇性壓力中扮演重要角色。
　　第二節(jié) 體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中白念珠菌藥物敏感性變化的研究
　　目的:比較在體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中，懸浮狀態(tài)菌與生物膜狀態(tài)菌對(duì)抗真菌藥物敏感性的差

5、異。方法:參照CLSI-M27-A3法推薦的酵母菌微量液基稀釋法對(duì)浮游狀態(tài)菌株進(jìn)行常用抗真菌藥(氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、卡泊芬凈和兩性霉素B)藥物敏感性的測(cè)定;在96孔組織培養(yǎng)板中構(gòu)建白念珠菌生物膜的體外模型，參照Pierce的生物膜藥物敏感性試驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)菌株在浮游狀態(tài)對(duì)卡泊芬凈和兩性霉素B均維持敏感，對(duì)氟康唑、伊曲康唑和伏立康唑的MIC值呈梯度性增高，其中Ca17對(duì)三種唑類藥物均耐藥。所有實(shí)驗(yàn)菌株在形

6、成生物膜后，對(duì)氟康唑呈高度耐藥，對(duì)伊曲康唑和伏立康唑的耐藥性也顯著增加，兩性霉素B可在較高濃度抑制白念珠菌生物膜，卡泊芬凈對(duì)白念珠菌生物膜仍維持敏感。結(jié)論:在獲得性耐藥形成過(guò)程中，白念珠菌的藥物敏感性逐漸下降。與游離狀態(tài)相比，生物膜對(duì)藥物的抵抗性更強(qiáng)。唑類藥物耐藥程度增加最明顯;兩性霉素B在較高濃度可抑制白念珠菌生物膜，但其副作用大，臨床應(yīng)用受限;卡泊芬凈對(duì)白念珠菌生物膜的殺傷作用較強(qiáng)，可作為臨床抗白念珠菌生物膜感染的一線藥物。

7、　　第三章 體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中實(shí)驗(yàn)菌株轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析
　　目的:研究白念珠菌在體內(nèi)獲得性耐藥進(jìn)程中基因的表達(dá)變化。方法:對(duì)第一章所用6株株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)，比較親本和MIC值最高的菌株之間的基因表達(dá)差異以及隨MIC逐漸升高有顯著改變的基因;進(jìn)行相關(guān)基因的功能注釋及生物學(xué)通路分析等研究。結(jié)果:Ca17與Ca1相比，共有55條基因表達(dá)差異明顯，其中有49條基因表達(dá)明顯上調(diào)，6條基因表達(dá)明顯下調(diào)。上調(diào)幅度最大的是MD

8、R1，其次是CDR1、CDR2等。首次發(fā)現(xiàn)在用藥前后出現(xiàn)明顯改變的基因有HWP1、GLX3、GEF2、HSL1、MED9、OYE32、PS19A、HST、NAD4、NAD5、NAD4L、PGA31、GST3等。表達(dá)上調(diào)的差異基因多與耐藥和氧化應(yīng)激相關(guān)。隨MIC逐漸升高有相關(guān)關(guān)系改變的基因共有655條，其中顯著改變的有303條，差異基因主要富集在與代謝有關(guān)的功能和生物通路上。結(jié)論:白念珠菌獲得性耐藥的最終形成是多個(gè)基因在不同時(shí)段通過(guò)不同的