GCS和MDR1在白血病細(xì)胞多藥耐藥形成中相關(guān)性的研究.pdf

1、目的:研究葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶(Glucosylceramide synthase,GCS)和多藥耐藥基因1(multidrug resistance1,MDR1)在人白血病多藥耐藥細(xì)胞株K562/A02細(xì)胞耐藥形成中基因和蛋白水平的相關(guān)性及其協(xié)同機(jī)制,以便為逆轉(zhuǎn)白血病細(xì)胞耐藥提供新的思路。
　　 方法:
　　 (1)利用RT-PCR方法檢測野生株K562及其耐藥株K562/A02細(xì)胞GCS、MDR1基因的表達(dá)情況。

2、r>　　 (2)采用RNA干擾技術(shù)(RNAinterference,RNAi),將靶基因?yàn)镚CS的小干擾RNA(GCSsiRNA)和靶基因?yàn)镸DR1的小干擾RNA(MDR1siRNA)分別轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞48小時(shí)后,通過定性和實(shí)時(shí)定量PCR的方法觀察GCS及MDR1 mRNA的基因沉默現(xiàn)象及兩者之間的交互影響。
　　 (3)利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測GCSsiRNA轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞24小時(shí)后其GCS及MDR1

3、mRNA的表達(dá)情況,并對(duì)比分析轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá),以進(jìn)一步探討GCS及MDR1 mRNA的交互影響。
　　 (4)將GCSsiRNA和 MDR1siRNA分別轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞72小時(shí)后,提取各組總蛋白,采用傳統(tǒng)Westem-blot免疫印跡法,分析P-糖蛋白表達(dá)差異,從蛋白水平探尋GCS和MDR1的相關(guān)性及協(xié)同分子病理機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 (1)K562/A02細(xì)胞GCS和MDR1 mRNA

4、的表達(dá)明顯強(qiáng)于野生株K562細(xì)胞。
　　 (2)RNA干擾實(shí)驗(yàn)表明:轉(zhuǎn)染48小時(shí)后GCSsiRNA組K562/A02細(xì)胞GCS和MDR1基因的表達(dá)均被抑制,抑制率分別為73％(59～82％)和67％(38-82％),P<0.01:MDR1siRNA組K562/A02細(xì)胞MDR1基因被抑制,抑制率為81(63-91)％,P<0.01,但GCS基因表達(dá)無明顯差異,P>0.05。
　　 (3)GCSsiRNA轉(zhuǎn)染K562/A0

5、2細(xì)胞24小時(shí)后,以Mock組為對(duì)照、GAPDH基因?yàn)閮?nèi)標(biāo),實(shí)驗(yàn)組GCS mRNA表達(dá)水平明顯受抑制,抑制率為69％(58～78％),P<0.01；以陰性組為對(duì)照,按公式計(jì)算,實(shí)驗(yàn)組MDR1 mRNA表達(dá)水平無明顯差異,P>0.05。與GCSsiRNA轉(zhuǎn)染K562/A02細(xì)胞24小時(shí)比較,轉(zhuǎn)染48小時(shí)后MDR1mRNA表達(dá)下調(diào)65％(54～74％),P<0.01；GCS mRNA表達(dá)水平無明顯差異,P>0.05。
　　 (4)與

6、K562/A02細(xì)胞空白組比較,轉(zhuǎn)染72小時(shí)后GCSsiRNA組和MDR1 siRNA組細(xì)胞P-gp表達(dá)的相對(duì)光密度值分別下調(diào)1.44倍和3.54倍,P<0.05。
　　 結(jié)論:GCS與MDR1 mRNA的表達(dá)在K562/A02細(xì)胞呈正相關(guān),特異性的沉默GCS基因可以下調(diào)MDR1 mRNA和P-糖蛋白的表達(dá),而且這種下調(diào)是繼發(fā)性的并呈一定的時(shí)間依賴性,兩者之間可能存在一定的內(nèi)在調(diào)控通路。由此,我們認(rèn)為葡萄糖神經(jīng)酰胺合成酶和經(jīng)典的