發(fā)芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的制備、性質(zhì)及應(yīng)用研究.pdf

1、α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase，α-D-Galactoside galactohydrolase，α-Gal； EC3.2.1.22)也稱蜜二糖酶，是一種外切糖苷酶。來源于咖啡豆的α-半乳糖苷酶具有將半乳糖轉(zhuǎn)移到環(huán)糊精上的功能，從而酶法合成α-半乳糖基.環(huán)糊精。α-半乳糖基-環(huán)糊精是一種分支環(huán)糊精，具有廣闊的應(yīng)用前景。本文從發(fā)芽咖啡豆中分離純化得到α-半乳糖苷酶，詳細(xì)研究了該酶的酶學(xué)性質(zhì)，酶法合成了α-半乳糖基-β-環(huán)糊

2、精，并確定其結(jié)構(gòu)。
　　 以培養(yǎng)35d的發(fā)芽咖啡豆為原料，冷凍24h(-40℃)后干法粉碎，提取液(水溶液：含有0.9%氯化鈉，0.1mmol/L乙二胺四乙酸，pH4.8)粗提α-半乳糖苷酶。其它條件：料液比1:5，時間30min，攪拌速度100r/min。此條件下得到的α-半乳糖苷酶總酶活為132.60nkat，比酶活為6.44nkat/mg。采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化粗提條件，優(yōu)化后的條件：料液比1:5，時間35min，攪拌速度1

3、50r/min，pH5.0。此條件下α-半乳糖苷酶總酶活為148.00nkat，比酶活為7.16nkat/mg，總酶活和比酶活都得到提高。α-半乳糖苷酶提取過程中，植物多酚造成嚴(yán)重的干擾，必須去除此物質(zhì)。采用50%(V/V)丙酮去除粗提液中的植物多酚，去除率為76.4%，效果明顯。去除植物多酚后，α-半乳糖苷酶總酶活為129.05nkat，比酶活為8.26nkat/mg?？偯富钣兴档?，但比酶活顯著提高，有利于α-半乳糖苷酶的分離純化。

4、
　　 通過硫酸銨沉淀，DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜和Sephacryl S-200-HR凝膠過濾色譜等分離純化技術(shù)，從發(fā)芽咖啡豆粗酶液中分離得到α-半乳糖苷酶。經(jīng)過變性凝膠電泳分析，該酶出現(xiàn)單一譜帶，分子量為38.805Da。經(jīng)過分離純化之后，發(fā)芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的比酶活達(dá)到191.50nkat/mg，純化倍數(shù)為23.18倍。
　　 以對硝基苯酚-α-半乳糖苷為底物，研究分離純化后

5、的發(fā)芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)。α-半乳糖苷酶的最適溫度45℃，熱穩(wěn)定溫度范圍20-50℃，最適pH6.0，pH穩(wěn)定范圍5.0-7.0。Na+、K+、Mg+和Cu2+對α-半乳糖苷酶的酶活影響不大，Zn2+促進(jìn)酶活，Ba2+對酶活稍有抑制，Hg2+強(qiáng)烈抑制α-半乳糖苷酶的活性。在0-0.25mol/L離子強(qiáng)度(氯化鈉)范圍內(nèi)，α-半乳糖苷酶的酶活不受影響。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，測定α-半乳糖苷酶的Km為0

6、.556mmol/L，Vmax為1.19μmol/min。一定濃度條件下，化學(xué)修飾劑對α-半乳糖苷酶的化學(xué)修飾結(jié)果顯示：色氨酸是α-半乳糖苷酶活性中心的必需氨基酸，-SH、-COOH和組氨酸對α-半乳糖苷酶的活性有影響，精氨酸、賴氨酸和-S-S-不是α-半乳糖苷酶活性中心的必需基團(tuán)。鄒氏作圖法顯示α-半乳糖苷酶活性中心的必需色氨酸數(shù)目為1。
　　 采用發(fā)芽咖啡豆α-半乳糖苷酶酶法合成分支環(huán)糊精。以蜜二糖(0.8mol/L)為供體

7、，β-環(huán)糊精(0.4mol/L)為受體，反應(yīng)緩沖液為醋酸緩沖液(50mmol/L，pH6.0)，α-半乳糖苷酶用量為50nkat。反應(yīng)條件：溫度30℃，時間36h，振蕩速度100 r/min。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)品的高效液相色譜分析表明：有β-環(huán)糊精的衍生物生成。通過制備型高效液相色譜分離得到純化樣品。經(jīng)過質(zhì)譜分析和樣品酶解產(chǎn)物的高效液相色譜分析，確定該樣品為單取代的α-半乳糖基-β-環(huán)糊精。通過傅里葉變換紅外光譜和核磁共振分析，得出α-半乳

8、糖基-β-環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)：一個半乳糖通過α-1，6糖苷鍵與一個β-環(huán)糊精連接。α-半乳糖基-β-環(huán)糊精為單取代-6-O-α-D-半乳糖(吡喃)基-β-環(huán)糊精。
　　 通過發(fā)芽咖啡豆α-半乳糖苷酶酶法合成α-半乳糖基-β-環(huán)糊精動力學(xué)研究可以得到合適的參數(shù)：pH6.8，酶用量60nkat，β-環(huán)糊精0.4mol/L，蜜二糖0.8mol/L。由Plackett-Burman設(shè)計篩選出酶用量，時間和pH這三個影響α-半乳糖基-β-環(huán)糊精