Notch信號通路經(jīng)ROCK2對缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細胞凋亡的影響.pdf

1、缺血性心臟病是因冠狀動脈循環(huán)改變導(dǎo)致心肌缺血缺氧或壞死而引起的心臟病，嚴重危害著人類健康，從分子水平探索預(yù)防和治療缺血性心臟病的新策略有重要的意義。在心肌受損后，Notch信號通路在促進心肌保護和損傷修復(fù)方面的功能十分明顯，而ROCK基因在調(diào)控心肌細胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用，因此我們推測在心肌細胞缺血缺氧背景下，Notch信號通路和ROCK基因在調(diào)控心肌細胞凋亡過程中存在著特定的關(guān)聯(lián)。
　　 目的：(1)探討Notch信號通

2、路對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡的影響；(2)初步探討缺氧損傷后Notch信號通路調(diào)控ROCK2基因表達的作用機制，進而揭示心肌受損后Notch信號通路在調(diào)控心肌細胞凋亡和損傷修復(fù)過程中的分子機制。
　　 方法：(1)RT-PCR擴增編碼H9c2心肌細胞Notch1胞內(nèi)段(NICD)全長DNA序列，重組入pCMV-Tag2B質(zhì)粒表達載體中，酶切、測序鑒定。將H9c2心肌細胞隨機分四組：pCMV-Tag2B-NICD組、p

3、CMV-Tag2B組、脂質(zhì)體組(Lipofectamine)和Control組，使用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒于H9c2心肌細胞，Western blot檢測NICD表達情況；(2)對體外培養(yǎng)的H9c2細胞進行缺氧復(fù)氧(21 h/6 h)，模擬大鼠心肌缺血再灌注模型，將H9c2心肌細胞隨機分為6組，正常對照組(Control組)、缺氧/復(fù)氧組(H/R)、NICD轉(zhuǎn)染預(yù)處理組(NICD組)、NICD轉(zhuǎn)染預(yù)處理+缺氧/復(fù)

4、氧組(NICD+H/R組)、Notch信號通路特異性抑制劑γ-分泌酶抑制劑處理組(DAPT組)、γ-分泌酶抑制劑處理+缺氧/復(fù)氧組(DAPT+H/R組)。采用Annexin V/PI雙染色法及流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，western blot檢測胞內(nèi)NICD和ROCK2蛋白表達情況。
　　 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-Thg2B-NICD，轉(zhuǎn)染H9c2心肌細胞，western blot顯示重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細

5、胞后NICD蛋白表達水平明顯增高(P<0.05)；(2)與Control組相比，過表達NICD后，ROCK2蛋白表達降低(P<0.05)，H9c2心肌細胞凋亡率下降(P<0.05)；抑制NICD后，ROCK2蛋白表達升高(P<0.05)，H9c2心肌細胞凋亡率升高(P<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pCMV-Tag2B-NICD；(2)缺氧/復(fù)氧處理后的H9c2心肌細胞中，Notch1蛋白表達升高，ROCK2