表沒食子兒茶素沒食子酸酯對棕櫚酸誘導(dǎo)H9C2心肌細胞凋亡的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的：隨著人們生活水平的日益提高，無論在發(fā)達國家或是發(fā)展中國家，代謝綜合征發(fā)病率逐漸升高。2型糖尿病、肥胖等，已成為人類健康的重大威脅。此類人群比正常人群更易出現(xiàn)心血管疾病，其原因在于：長期的、慢性的血脂肪酸水平升高，可導(dǎo)致動脈粥樣硬化，并可損傷冠狀動脈內(nèi)皮細胞，導(dǎo)致缺血性心肌損傷；值得引起重視的是，高脂肪酸水平也可直接損傷心肌細胞，誘導(dǎo)細胞凋亡，稱為脂毒性心肌損傷。棕櫚酸(palmitate，PA)，一種常見的飽和脂肪酸，被廣泛應(yīng)用于

2、體外細胞培養(yǎng)，制造脂毒性損傷模型進行實驗研究。PA已被證實可誘導(dǎo)包括心肌細胞在內(nèi)的多種組織細胞凋亡，而心肌細胞凋亡是心功能衰竭、再灌注損傷等的重要原因。因此，減輕心肌細胞凋亡可能是對抗脂毒性心肌損傷的關(guān)鍵策略。臨床試驗證實，長期、規(guī)律攝入綠茶可以降低血清膽固醇水平、降低體內(nèi)脂肪含量、抑制脂肪細胞生成、降低體重，對于維持體內(nèi)脂質(zhì)代謝的穩(wěn)態(tài)具有重要作用。作為綠茶中提取的茶多酚生物活性的主要成份，表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigalloca

3、techin-3-gallate，EGCG)被證實具有極強的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用，被廣泛應(yīng)用于心血管領(lǐng)域和腫瘤領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究。重要的是，也有研究證實，無論是在體動物模型還是體外細胞模型，EGCG對于脂質(zhì)代謝均可發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。在體動物實驗證實，于飲食中加入一定劑量EGCG可降低血清膽固醇含量和身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)。體外細胞實驗證實，EGCG可直接減輕PA導(dǎo)致的脂毒性內(nèi)皮細胞凋亡。以上證據(jù)提示，EGC

4、G具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和保護脂毒性損傷的雙重作用。然而，針對EGCG對于心肌細胞的脂毒性損傷是否具有保護作用，目前尚未明確。本研究擬通過高脂培養(yǎng)基進行H9C2心肌細胞體外培養(yǎng)，建立心肌細胞脂毒性損傷模型，通過ERS抑制劑4-PBA研究ERS相關(guān)的凋亡在高脂損傷中的作用，研究脂毒性心肌損傷的分子機制;探討EGCG預(yù)處理對于心肌細胞高脂損傷的保護作用，并通過信號通路抑制劑進一步研究EGCG對抗脂毒性心肌損傷的相關(guān)分子機制。
　　方法：⑴將

5、H9C2心肌細胞分為4組，對照組培養(yǎng)基中含有0.1％BSA，模型組分別以不同濃度(100μM、200μM、400μM) PA培養(yǎng)12小時，油紅O染色法鑒定高脂模型建立。⑵采用不同濃度的PA(0-500μM)處理細胞不同的時間（0小時，6小時，12小時，24小時），通過CCK-8法檢測細胞活力，并根據(jù)該檢測結(jié)果選擇后續(xù)實驗中合適的PA處理條件。⑶將H9C2心肌細胞分為4組，對照組培養(yǎng)基中含有0.1％BSA，模型組分別以不同濃度（100μM

6、、200μM、400μM）PA培養(yǎng)12小時，誘導(dǎo)脂毒性損傷。分別用可見分光光度計檢測細胞培養(yǎng)上清液中LDH含量，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況，western blot技術(shù)檢測不同濃度PA對心肌細胞中GRP78，CHOP， Cleaved caspase-12，PERK/eIF2α通路分子表達的影響。⑷將H9C2心肌細胞分為5組:分別以PA400μM培養(yǎng)不同時間（0小時，3小時，6小時，12小時，24小時），以western blot技術(shù)檢

7、測PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α，ATF4，CHOP，Cleaved caspase-12的表達情況，探討PERK通路分子和ERS相關(guān)凋亡蛋白在PA誘導(dǎo)脂毒性損傷過程中的變化規(guī)律。⑸將H9C2心肌細胞分為3組：對照組培養(yǎng)基中含有0.1％BSA，培養(yǎng)12小時；PA模型組以PA400μM培養(yǎng)12小時；4-PBA組:先以5mM的4-PBA預(yù)處理90分鐘，再加入PA400μM共同培養(yǎng)12小時。以流式細胞術(shù)檢測4-PBA對PA

8、導(dǎo)致細胞凋亡的影響，以western blot技術(shù)檢測4-PBA對PA培養(yǎng)下ERS相關(guān)凋亡蛋白CHOP、Cleaved caspase-12的影響。⑹以不同濃度（1.0μM，5.0μM，10μM，25μM，50μM）的EGCG預(yù)處理細胞后加入PA400μM共同培養(yǎng)12小時，以CCK-8法檢測EGCG對于PA培養(yǎng)下細胞活力的影響，根據(jù)該檢測結(jié)果選擇后續(xù)實驗中合適的EGCG處理條件。⑺選擇具有最佳保護作用的2個濃度EGCG5μM和10μM作

9、為后續(xù)實驗條件，檢測培養(yǎng)上清液中LDH含量、DAPI染色檢測細胞凋亡、western blot技術(shù)檢測p-Akt與Akt表達。進一步觀察EGCG的保護作用及對PI3K/Akt信號通路的調(diào)控作用。⑻在EGCG實驗基礎(chǔ)上，加入PI3K/Akt信號通路抑制劑LY294002，以western blot技術(shù)檢測Cleavedcaspase-3，CHOP，Cleaved caspase-12，PERK，p-PERK，eIF2α，p-eIF2α蛋白

10、表達，探討EGCG對抗脂毒性損傷作用的分子機制。
　　結(jié)果：①PA培養(yǎng)12小時即可導(dǎo)致H9C2細胞活力下降，從PA200μM至500μM心肌細胞活力逐漸下降，呈PA劑量依賴性。選擇PA100μM，200μM，400μM進行后續(xù)實驗，發(fā)現(xiàn)PA200μM以上濃度處理12小時可引起LDH釋放增加。②流式細胞術(shù)結(jié)果提示PA200μM以上濃度可引起細胞凋亡率增加;western blot結(jié)果提示PA可上調(diào)ERS標(biāo)志性分子GRP78、ERS凋

11、亡蛋白CHOP和Cleaved caspase-12、PERK通路蛋白的表達，且上述改變均呈現(xiàn)明顯的正性PA劑量依賴性。③以PA400μM處理細胞3小時、6小時、12小時、24小時，western blot技術(shù)結(jié)果提示，PERK分子在PA處理后的3小時顯著激活，表現(xiàn)為磷酸化水平的提高;作為p-PERK的特異性底物，p-eIF2α在3小時顯著激活，6小時達峰值;下游的ATF4在PA處理的6小時顯著激活，此后表達量逐漸升高，24小時達峰值。

12、作為ERS相關(guān)凋亡的特異性分子，CHOP和Cleaved caspase-12在PA處理的12小時表達量顯著提高，并持續(xù)至PA處理后的24小時。④流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，以ERS特異性抑制劑4-PBA5mM預(yù)處理90分鐘，顯著降低PA導(dǎo)致的心肌細胞凋亡，western blot結(jié)果提示4-PBA可顯著下調(diào)ERS相關(guān)凋亡特異性蛋白CHOP和Cleaved caspase-12的表達，說明ERS相關(guān)的凋亡作為重要機制參與PA導(dǎo)致的心肌細胞脂毒性

13、損傷。⑤以EGCG預(yù)處理細胞，CCK-8結(jié)果顯示EGCG5μM和10μM對于PA400μM導(dǎo)致的細胞損傷有最佳保護作用，該結(jié)果被進一步的LDH含量和DAPI染色結(jié)果所證實。PA處理可顯著降低心肌細胞的Akt分子磷酸化水平，EGCG5μM和10μM可部分恢復(fù)Akt分子的磷酸化水平的降低，發(fā)揮上調(diào)PI3K/Akt信號通路活性，對抗脂毒性損傷的作用。⑥EGCG10μM預(yù)處理前加入LY294002預(yù)處理1小時，可部分抵消EGCG10μM對于脂毒

14、性損傷的保護作用，體現(xiàn)為:EGCG降低凋亡率、下調(diào)凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved caspase-3表達、下調(diào)ERS特異性凋亡蛋白CHOP和Cleaved caspase-12的表達、抑制PERK/eIF2α通路過度活化的作用均被LY294002部分抵消。
　　結(jié)論：⑴PA可呈劑量依賴性和時間依賴性的方式激活H9C2心肌細胞ERS、PERK/eIF2α/ATF4信號通路，繼而激活ERS相關(guān)的凋亡通路，導(dǎo)致細胞損傷。ERS抑制劑4-PB

15、A可顯著減輕PA導(dǎo)致的心肌細胞凋亡。⑵EGCG可提高PA培養(yǎng)下的H9C2心肌細胞活力，降低細胞凋亡率及凋亡蛋白Cleaved caspase-3的表達，降低LDH釋放，對抗脂毒性損傷。⑶EGCG可上調(diào)PA培養(yǎng)下的H9C2心肌細胞PI3K/Akt信號通路活性，進而抑制ERS、PERK/eIF2α信號通路的過度激活，下調(diào)ERS相關(guān)凋亡蛋白CHOP、Cleaved caspase-12的表達，減輕細胞凋亡。PI3K/Akt信號通路抑制劑LY2