臺(tái)灣線蟲(chóng)草發(fā)酵菌絲體的自由基清除活性成分研究.pdf

1、本文對(duì)臺(tái)灣線蟲(chóng)草Ophiocordyceps formosana Kobayasi& Shimizu發(fā)酵菌絲體的自由基清除活性及成分進(jìn)行了系統(tǒng)的研究分析，內(nèi)容包括對(duì)臺(tái)灣線蟲(chóng)草 RCEF0868和RCEF5491菌株進(jìn)行了液體發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵菌絲體的凍干粉；以DPPH、羥自由基和超氧自由基的清除活性為指標(biāo)，選擇自由基清除活性較優(yōu)菌株并對(duì)提取溶劑進(jìn)行了優(yōu)化選擇；以優(yōu)化選擇的提取劑對(duì)較優(yōu)菌株RCEF0868進(jìn)行提取處理，得粗提物凍干粉并對(duì)其

2、 DPPH和羥自由基的清除活性進(jìn)行定量分析；通過(guò) HPLC分離和活性測(cè)定的方式對(duì)主要活性成分進(jìn)行了初步定位分析，并根據(jù)LC-MS的分析結(jié)果對(duì)活性成分的分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步的分析和推斷；根據(jù)自由基清除活性定量分析和活性成分的液質(zhì)聯(lián)用初步定性結(jié)果，進(jìn)一步以 DPPH自由基的清除活性為指標(biāo)，對(duì)RCEF0868菌株有關(guān)活性物質(zhì)進(jìn)行了提取方法的優(yōu)化。
　　較優(yōu)菌株和提取溶劑的選擇結(jié)果表明：RCEF0868菌株的自由基清除活性相對(duì)較好，不

3、同溶劑提取物對(duì)自由基的清除活性存在較大差異，以水和甲醇兩種提取物的活性較高。因此，本研究選定RCEF0868菌株為研究對(duì)象，對(duì)其水提取和甲醇提取物的DPPH和羥自由基清除活性進(jìn)行進(jìn)一步分析。
　　RCEF0868菌株活性定量分析結(jié)果表明：隨樣品濃度的遞增，其水提物和甲醇提取物對(duì)兩種自由基的清除活性有所增強(qiáng)，當(dāng)提取物濃度為5.0mg/ml時(shí)，反應(yīng)20min后，水提取和甲醇提取物對(duì)DPPH的清除率分別達(dá)到87.83％和91.70%，其

4、半抑制濃度 IC50分別為0.85mg/ml和1.23mg/ml；對(duì)羥自由基的清除率分別達(dá)到90.04%和61.60%，其半抑制濃度 IC50分別為1.37mg/ml和2.91mg/ml。綜上可知，RCEF0868菌株的水提取和甲醇提取物對(duì)DPPH均具有較好的清除活性，另外水提物對(duì)羥自由基的清除活性也較好，而甲醇提取物對(duì)羥自由基的清除活性相對(duì)較弱。
　　活性組分的HPLC分離測(cè)定和LC-MS分析結(jié)果表明：水提取物中共檢測(cè)出三個(gè)活性

5、成分，其分子式分別為C6H14O6(1)、C14H17N5O8(2)和C20H33N5O9(3)；在甲醇提取物中檢測(cè)出的活性成分除化合物1外，還包括 C30H22O11(4)、C30H22O10(5)和C30H18O10(6)，以上六種成分均表現(xiàn)出DPPH自由基清除活性，其中化合物1、4和5同時(shí)還具有羥基自由基的清除活性。通過(guò)查詢天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)和參閱報(bào)道初步推斷，化合物3可能為一種新化合物，其他化合物依次為D-Mannitol、Succ

6、inoadenosine、4a-Oxyrugulosin、Rugulosin和Skyrin，其中Succinoadenosine和4a-Oxyrugulosin為首次在蟲(chóng)生真菌中發(fā)現(xiàn)。
　　提取優(yōu)化中單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：料液比(mg/ml)、溫度(℃)和甲醇體積比率(%)是影響DPPH自由基清除率相對(duì)主要的因素。進(jìn)一步的三因素響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果表明：料液比(x1)和甲醇體積比率(x3)這兩種因素對(duì)DPPH清除率(y)影響顯著(P<0.