大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌發(fā)酵菌絲活性成分分析及抗腫瘤機(jī)制研究.pdf

1、大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌屬于線蟲(chóng)草科，寄生在樹(shù)林下面的大團(tuán)囊菌中，是我國(guó)稀貴的藥用真菌，民間主要用于治療血崩和月經(jīng)不調(diào)。由于野生資源匱乏，野外采集大團(tuán)囊蟲(chóng)草比較困難，近些年國(guó)內(nèi)外對(duì)于大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌的研究并不是很多，缺少對(duì)其發(fā)酵菌絲系統(tǒng)的化學(xué)成分分析，也很少涉及其活性成分的作用機(jī)理。中國(guó)醫(yī)藥古籍的記載缺乏對(duì)大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌物質(zhì)基礎(chǔ)的清晰闡述，嚴(yán)重制約了大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌的深度開(kāi)發(fā)。針對(duì)上述問(wèn)題，本論文對(duì)珍貴的藥用真菌大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌發(fā)酵菌絲進(jìn)行了較為系統(tǒng)的化學(xué)成分分

2、析，對(duì)其中活性化合物進(jìn)行了初步的抗腫瘤活性篩選和抗腫瘤作用機(jī)制研究。
　　 1.對(duì)大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌發(fā)酵菌絲進(jìn)行了較系統(tǒng)的化學(xué)成分分析，結(jié)合現(xiàn)代波譜技術(shù)鑒定得到14個(gè)化合物，包括2個(gè)甾醇類(lèi)、4個(gè)為倍半萜類(lèi)、1個(gè)蒽醌類(lèi)、4個(gè)多酚類(lèi)、1個(gè)酚類(lèi)和2個(gè)黃酮苷類(lèi)化合物，其中13個(gè)化合物首次從大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌發(fā)酵菌絲中分離到。4個(gè)倍半萜類(lèi)化合物是新化合物，分別被命名為大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌素A、B、C和D，已經(jīng)提交了專(zhuān)利申請(qǐng)(201110111071.5)，其

3、中3個(gè)含有螺[4.5]癸烷骨架、屬于菖蒲烷型倍半萜，另一個(gè)則是血管生成抑制劑5-demethoxyfumagillol的衍生物。2個(gè)黃酮苷類(lèi)化合物均為含呋喃型五碳糖的苷類(lèi)，從已知數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)來(lái)看，很有可能是新的天然產(chǎn)物。同時(shí)我們又對(duì)大團(tuán)囊蟲(chóng)草菌萃取物的部分油狀組分進(jìn)行了GC-MS分析，鑒定出了13種揮發(fā)性成分，包括1個(gè)酚類(lèi)、1個(gè)烯類(lèi)、1個(gè)甾醇酯類(lèi)、3個(gè)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸類(lèi)和7個(gè)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸酯類(lèi)化合物。
　　 2.體外抗腫瘤活性

4、篩選發(fā)現(xiàn)新化合物3對(duì)HepG2、Hela和A549作用24 h后的IC50分別為36.2μg/ml、21.1μg/ml和40.2μg/ml，對(duì)于MCF-7沒(méi)有明顯殺傷作用，而化合物9對(duì)于HepG2、Hela、A549和MCF-7作用24 h后的IC50分別為39.45μg/ml、66.35μg/ml、37.9μg/ml和18.9μg/ml，且化合物3和9對(duì)于正常的人肝細(xì)胞L-02沒(méi)有明顯的生長(zhǎng)抑制作用(IC50＞80μg/ml)。同時(shí)，

5、對(duì)多酚類(lèi)化合物Daidzein抑制腫瘤細(xì)胞MDA-MB-231轉(zhuǎn)移進(jìn)行了探索，并以層孔菌來(lái)源的多酚類(lèi)化合物Hispolon為對(duì)照，結(jié)果表明Daidzein盡管具有抗腫瘤作用，但沒(méi)有很強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性，而Hispolon可以通過(guò)減少細(xì)胞內(nèi)金屬基質(zhì)蛋白酶-9(MMP-9)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)抑制MDA-MB-231細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。
　　 3.對(duì)新化合物9(Cordycepol C)抑制肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的機(jī)制進(jìn)行了初步研究。發(fā)現(xiàn)Co

6、rdycepol C能誘導(dǎo)細(xì)胞染色質(zhì)濃縮并形成凋亡小體、PARP-1蛋白剪切、核內(nèi)基因組DNA斷裂和細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(PS)外翻，這些凋亡典型特征的出現(xiàn)表明Cordycepol C能誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且CordycepolC可以使HepG2細(xì)胞發(fā)生G2期阻滯。Cordycepol C不能激發(fā)HepG2細(xì)胞內(nèi)Caspases的活性及Caspases蛋白的剪切，而泛Caspases抑制劑Z-VAD-fmk也即不能抑制Cordy

7、cepol C對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷作用，也不能抑制Cordycepol C誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)的凋亡特征，說(shuō)明Cordycepol C誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生Caspase非依賴(lài)性細(xì)胞凋亡。Western blot實(shí)驗(yàn)表明Cordycepol C可以誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白Bax表達(dá)量的上調(diào)，同時(shí)使Bax蛋白發(fā)生線粒體轉(zhuǎn)移；細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的下降呈藥物劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性，線粒體內(nèi)的促凋亡因子AIF和EndoG在用藥6h后發(fā)生了核轉(zhuǎn)移