重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)角質(zhì)酶發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、角質(zhì)酶是一種多功能酶，屬于絲氨酸酯酶，具有稱作α/β水解酶折疊的共同結(jié)構(gòu)框架的蛋白質(zhì)。作為酯酶的一種，角質(zhì)酶在工業(yè)產(chǎn)品和生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用表現(xiàn)出脂肪酶的特性，它既可以參與水解反應(yīng)也可以參與合成反應(yīng)。因此其在奶制品工業(yè)、洗滌劑工業(yè)、化妝品工業(yè)、甘油三酯、多聚體、表面活性劑、護(hù)膚產(chǎn)品、藥物以及農(nóng)業(yè)化學(xué)藥品等方面都表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用。角質(zhì)酶在紡織上的應(yīng)用是近幾年興起的新的研究方向，在染色方面和傳統(tǒng)工藝相比能夠提高潤濕性和水解纖維的能力，縮短處理時(shí)

2、間、減少蒸汽和電力消耗以及保護(hù)環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。 本論文以一株高積累角質(zhì)酶的重組枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisWSH06—07)為出發(fā)菌株，以角質(zhì)酶的高產(chǎn)量、高得率和高生產(chǎn)強(qiáng)度為目標(biāo)，采用針對(duì)發(fā)酵過程的外因定性優(yōu)化(基于微生物反應(yīng)原理的培養(yǎng)環(huán)境優(yōu)化技術(shù))、內(nèi)因定性優(yōu)化(基于代謝特性的分階段培養(yǎng)技術(shù))等一系列技術(shù)對(duì)角質(zhì)酶發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化，研究的主要結(jié)果如下： 1.種齡對(duì)發(fā)酵的影響較大，實(shí)驗(yàn)考察了種子的生長情況：9

3、～22h為種子的對(duì)數(shù)期，種齡為11h，將種子接入培養(yǎng)基中有利于菌體的發(fā)酵。 2.采用基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵，質(zhì)粒的穩(wěn)定性和細(xì)胞內(nèi)包涵體對(duì)產(chǎn)量影響很大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在整個(gè)發(fā)酵過程中，質(zhì)粒穩(wěn)定性能維持90％以上。此外，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳驗(yàn)證了細(xì)胞內(nèi)沒有包涵體，目的蛋白全部在發(fā)酵上清液中。 3.搖瓶水平上考察營養(yǎng)條件對(duì)B.subtilisWSH06—07生長和角質(zhì)酶合成的影響；通過單因素實(shí)驗(yàn)和Plackett—Burman實(shí)

4、驗(yàn)確定了蔗糖、蛋白胨以及硫酸鎂是影響角質(zhì)酶發(fā)酵的主要因素；在此基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法考察了各營養(yǎng)組分及其濃度的配比關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：蔗糖和硫酸鎂存在交互作用也是影響細(xì)胞生長和角質(zhì)酶合成的主要因素。最終確定角質(zhì)酶發(fā)酵的培養(yǎng)基組分為(g/L)：蔗糖32.5，蛋白胨37，酵母膏24，磷酸氫二鈉12.54，磷酸二氫鉀2.31，硫酸鎂4.4。進(jìn)一步確定較優(yōu)的環(huán)境條件組合為：初始pH7.5、裝液量75mL/500mL、接種量5％。 4

5、.在3L發(fā)酵罐中研究了溶氧對(duì)角質(zhì)酶分批發(fā)酵的影響。結(jié)果表明：在通氣量恒定的情況下，不同攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)菌體干重(DCW)和角質(zhì)酶產(chǎn)量沒有較大影響。因此，在蔗糖濃度為32.5g/L且通氣量控制在1.5vvm的前提下，將攪拌轉(zhuǎn)速恒定在600r/min即可滿足細(xì)胞生長和角質(zhì)酶合成對(duì)溶氧的需求。 5.不同pH控制模式對(duì)角質(zhì)酶分批發(fā)酵的影響有較大差異。在發(fā)酵過程中控制pH相對(duì)于不控制pH角質(zhì)酶產(chǎn)量有所提高?；诎l(fā)酵過程中不同pH對(duì)菌體比生長速率

6、及比產(chǎn)物合成速率的變化，確定了pH兩階段控制策略，即0～4h時(shí)控制pH7.5，4h后將pH調(diào)至6.5。通過采用這一優(yōu)化策略，角質(zhì)酶酶活有了較大的提高，達(dá)170U/mL，生產(chǎn)強(qiáng)度為16.9kU/(L·h)，比恒定pH7.5控制模式下分別提高了122.6％和123.2％。 6.實(shí)驗(yàn)考察了溫度對(duì)B.subtilisWSH06—07生長和產(chǎn)酶的影響。分批培養(yǎng)結(jié)果表明：溫度在27℃～40℃范圍內(nèi)，較高溫度對(duì)提高細(xì)胞生長速度有促進(jìn)作用，但在

7、40℃下質(zhì)粒丟失嚴(yán)重，而較低溫度有利于角質(zhì)酶的合成。在深入分析不同溫度下角質(zhì)酶分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的基礎(chǔ)上，提出了溫度分階段控制策略，即發(fā)酵前4h控制為溫度37℃，4h后切換至30℃并保持到發(fā)酵結(jié)束。采用這一最優(yōu)溫度兩階段控制策略，最高酶活和生產(chǎn)強(qiáng)度為312.5U/(mL)、13.02KU/(L·h)，比37℃分別提高了83.4％、10.9％。因此溫度兩階段控制策略對(duì)于提高角質(zhì)酶產(chǎn)量具有實(shí)際效果。 7.實(shí)驗(yàn)考察了不同初糖濃度對(duì)角質(zhì)酶分

8、批發(fā)酵的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：僅通過提高初糖濃度難以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和角質(zhì)酶高產(chǎn)量、高得率和高生產(chǎn)強(qiáng)度的有機(jī)統(tǒng)一。對(duì)此實(shí)驗(yàn)考察了分批補(bǔ)料、恒速流加培養(yǎng)方式對(duì)B.subtilisWSH06—07發(fā)酵生產(chǎn)角質(zhì)酶的影響。結(jié)果表明：這兩種補(bǔ)料培養(yǎng)方式都可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞和角質(zhì)酶的高產(chǎn)。綜合比較，恒速流加對(duì)于B.subtilisWSH06—07發(fā)酵培養(yǎng)來說，無論是細(xì)胞得率還是角質(zhì)酶的高產(chǎn)量、高得率和高生產(chǎn)強(qiáng)度都是較理想的選擇。經(jīng)過31h的恒速流加培養(yǎng)，DCW達(dá)到