百菌清水解脫氯酶(Chd)的枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)、發(fā)酵優(yōu)化及應(yīng)用.pdf

1、百菌清（四氯間苯二腈）是一種廣譜氯代苯腈類殺菌劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已使用30年之久，是世界上使用最廣泛的殺真菌劑之一，在環(huán)境中較穩(wěn)定、殘效期長，且具有明顯的蓄積毒性。百菌清的廣泛使用及其難降解的特性使得其在溫室大棚氣體、蔬菜和水果中都可被檢測到，其給人類健康和食品安全造成的嚴(yán)重威脅引起了廣泛關(guān)注。百菌清污染的生物降解被認(rèn)為是一種有效、安全可靠和無二次污染的方法，具有廣泛應(yīng)用前景。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期分離到一株高效降解百菌清的菌株P(guān)seu

2、domonas sp.CTN-3，其編碼的新穎百菌清水解脫氯酶(Chd)無需其他輔因子就能將百菌清水解為毒性變小、水溶性變大的羥基百菌清?？莶菅挎邨U菌由于其非致病性、分泌蛋白能力強(qiáng)和良好的發(fā)酵基礎(chǔ)應(yīng)用非常廣泛，是一些重要工業(yè)酶制劑的生產(chǎn)菌株。本論文將利用含P43啟動子功能片段和NprB基因信號肽編碼序列，將chd基因整合到大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pP43NMK中構(gòu)建分泌表達(dá)載體pP43Chd，將其轉(zhuǎn)化至枯草芽孢桿菌WB800的感受

3、態(tài)中，成功實(shí)現(xiàn)chd基因在枯草芽孢桿菌WB800中的高效胞外分泌表達(dá)，解決了Chd胞內(nèi)表達(dá)而后續(xù)分離純化難度高的難題。
　　重組枯草桿菌WB800(pP43Chd)經(jīng)液態(tài)發(fā)酵優(yōu)化（包括單因素實(shí)驗(yàn)、Placket-Burman實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken Design實(shí)驗(yàn)），發(fā)酵產(chǎn)Chd酶活提高了1.13倍，達(dá)到14.50 U/l。獲得最佳培養(yǎng)基配方為:蛋白胨30 g/l、葡萄糖50g/l、酵母提取物39g/l、磷酸氫二鉀3g/l、

4、氯化鈉3g/l、硫酸鎂3g/l。最佳培養(yǎng)條件為:接種量10％、pH7.0、30 ml/250 ml的裝液量、培養(yǎng)溫度37℃、搖床轉(zhuǎn)速175 rpm、培養(yǎng)12h后加入20 mg/l的百菌清，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后測酶活。
　　重組枯草桿菌WB800(pP43Chd)經(jīng)固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化后，發(fā)酵產(chǎn)Chd酶活提高了2.82倍，達(dá)到85.60 U/kg干基質(zhì)，獲得固態(tài)發(fā)酵最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件為:小麥稈粉和麩皮各2 g、稻谷殼1 g，K2HPO40.

5、4‰、MgSO40.2‰、蛋白胨5％、D-木糖5％,含水量為60％，接種量為20％,固體基質(zhì)顆粒大小＞2.96 mm、堆料高度為3.3 cm、堆料密度為0.047 g/cm3及孔隙度為84.86％時，37℃發(fā)酵36 h。
　　用最優(yōu)液態(tài)發(fā)酵條件下發(fā)酵生產(chǎn)的Chd粗酶液對代表不同植物器官的六種蔬菜進(jìn)行百菌清殘留降解實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明Chd粗酶液對西紅柿中百菌清的降解效果最好，百菌清的降解率接近100％，其次是萵苣和生菜，百菌清降解率分別