丹蔞片對雷帕霉素誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討丹蔞片對雷帕霉素誘導(dǎo)的人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，并試探明其可能的機(jī)制。
　　方法：
　　1．用不同劑量的雷帕霉素，依次作用在HAECs上，四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）測定 HA EC s細(xì)胞的增殖抑制率；通過計算細(xì)胞增殖抑制率、繪制增殖抑制曲線等，綜合分析雷帕霉素對HAEC s增殖活性的影響。
　　2．通過不同濃度的含藥兔血清與雷帕霉素共同作用于HAECs，四甲基偶氮唑鹽法（MTT法）測定HAE

2、C細(xì)胞的抑制率變化，摸索出適宜的含藥血清濃度進(jìn)行下一步實驗。
　　3．運用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，觀察含藥血清對雷帕霉素作用下細(xì)胞凋亡率的變化。
　　4．采用實時熒光定量 PCR技術(shù)及蛋白免疫印跡技術(shù)檢測對細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)凋亡（Caspase-3，Bax，Bcl-2）基因及蛋白表達(dá)的影響，運用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測PI3K/Akt通路中p-Akt蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：
　　1．雷帕霉素對HAECs有明顯的抑制細(xì)

3、胞生長的作用，與陰性對照組的比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P﹤0.05），并且成劑量和時間依賴性。
　　2．各組用不同濃度含藥血清處理后，在12h、24h、48h時間點，含5％、15%、20%濃度空白兔血清的雷帕霉素組與相對應(yīng)空白組相比，細(xì)胞存活率降低，且有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.05），5%、15%濃度丹蔞片組與雷帕霉素組相比，細(xì)胞存活率上升，且有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），但與可定組細(xì)胞存活率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），5%、15%混

4、合組與可定組和丹蔞片組相比細(xì)胞存活率升高，且均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。15%濃度含藥血清作用下各組細(xì)胞存活率最高，含藥血清濃度與細(xì)胞存活率之間不存在劑量依賴性。
　　3.各組選用1ng/ml濃度雷帕霉素作用下，15%含藥血清濃度處理細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞儀檢測凋亡率，丹蔞片組較雷帕霉素組凋亡率降低（18.23±1.36 vs23.23±0.76，P＜0.05），丹蔞片組與可定組之間無明顯差別（P＞0.05），混合組與丹蔞片、

5、可定組相比，凋亡率降低（14.87±0.61vs18.23±1.36，P＞0.05；14.87±0.61vs17.48±0.66，P＜0.05）。
　　4.熒光定量PCR檢測1ng/ml濃度雷帕霉素作用下15%含藥血清濃度處理細(xì)胞24h后相關(guān)凋亡基因表達(dá)，丹蔞片組與雷帕霉素組相比 Bax（4.46±0.45vs5.24±0.56）、Caspase-3(2.37±0.25vs3.96±0.22)表達(dá)量減少（P＜0.05），Bcl-2

6、表達(dá)量增加（0.58±0.06vs0.47±0.08，P＜0.05），丹蔞片組與可定組之間Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)量均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；混合組與丹蔞片相比Bax（2.88±0.47vs4.46±0.45，P＜0.05）、Caspase-3（1.63±0.28vs2.37±0.25，P＜0.05）表達(dá)量降低，Bcl-2表達(dá)量增加（0.83±0.08vs0.58±0.06，P＜0.05）。
　　5. We

7、stern-blot檢測1ng/ml濃度雷帕霉素作用下15%含藥血清濃度處理細(xì)胞24h后相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)及 p-Akt蛋白表達(dá)，丹蔞片組與雷帕霉素組相比 Ba x（63.26±5.06vs77.92±5.28）、Caspase-3（112.24±4.81vs147.14±7.94）表達(dá)量減少（P＜0.05），Bc l-2表達(dá)量增加（34.13±13.23 vs11.66±10.40，P＜0.05），丹蔞片組與可定組之間Bax、Bcl-2

8、、Caspase-3表達(dá)量均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）?；旌辖M與丹蔞片組相比Bax（31.76±5.75vs63.26±5.06）、Caspase-3（76.25±3.88vs112.24±4.81）表達(dá)量減少（P＜0.05），Bc l-2表達(dá)量增加（63.32±11.68 vs34.13±13.23，P＜0.05）。丹蔞片組與雷帕霉素組相比，p-Akt表達(dá)量減少（134.56±20.21 vs97.90±15.71，P＜0.05），

9、混合組與丹蔞片組相比p-Akt表達(dá)量減少（58.83±6.09vs97.90±15.71，P＜0.05），丹蔞片組與可定組相比無明顯差異（97.90±15.71vs83.15±9.99，P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．雷帕霉素對HAECs有促凋亡作用，且成劑量及時間依賴性，劑量越大，作用時間越長，對細(xì)胞抑制率越大。
　　2．丹蔞片能抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的HAECs凋亡，在雷帕霉素為1ng/ml時，15%濃度含藥血清抑