游離脂肪酸和葡萄糖誘導(dǎo)人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧產(chǎn)生的分子機(jī)制研究.pdf

1、背景: 游離脂肪酸介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在代謝綜合征心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。過(guò)量活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生可通過(guò)直接氧化損傷DNA，蛋白質(zhì)，脂質(zhì)等大分子物質(zhì)，或激活NF-κB，p38 MAPK，JNK等信號(hào)通路引起組織損傷和細(xì)胞功能異常。因此有效降低ROS產(chǎn)生，增加體內(nèi)抗氧化能力對(duì)預(yù)防糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生具有重要作用。 AMPK可啟動(dòng)分解代謝途徑從而增加ATP的產(chǎn)生，因

2、此在能量代謝調(diào)控中發(fā)揮重要作用。目前研究證實(shí)AMPK信號(hào)通路的激活具有保護(hù)心血管效應(yīng)。但機(jī)制不明。以往研究表明活性氧可激活A(yù)MPK通路。同時(shí)AMPK的激活可有效降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平。但是，AMPK通路的激活能否降低棕櫚酸（palmitic acid，PA）介導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的水平尚不清楚。 硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）系統(tǒng)清除活性氧及還原二硫鍵的功能使該系統(tǒng)成為維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的重要因素。許多研

3、究表明，Trx在多種刺激（特別是氧化應(yīng)激）下可誘導(dǎo)其表達(dá)的特性，提示Trx是細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激的重要分子，能保護(hù)組織或細(xì)胞免受多種刺激的損傷。然而，Trx是否參與AMPK通路對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的調(diào)節(jié)以及AMPK通路如何調(diào)節(jié)Trx的表達(dá)，均需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。 近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞周期、新陳代謝、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、抵抗氧化應(yīng)激、長(zhǎng)壽等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXOs還可直接調(diào)節(jié)Gadd45和錳超氧化

4、物歧化酶（manganese superoxide dismutase，MnSOD）基因表達(dá)，保護(hù)靜息細(xì)胞免受氧化損傷，促使DNA修復(fù)。FOXO轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用已部分闡明?，F(xiàn)有研究表明ROS可激活FOXO，但同時(shí)FOXO也可抵抗生理性氧化應(yīng)激，增加細(xì)胞存活。但是，F(xiàn)OXO是否為T(mén)rx的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，以及AMPK通路對(duì)FOXO的轉(zhuǎn)錄活性的影響尚不明確。 針對(duì)以上問(wèn)題，我們提出如下假說(shuō)：AMPK通路的激活能夠通過(guò)

5、增強(qiáng)抗氧化劑Trx的表達(dá)而降低細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的水平。FOXO作為轉(zhuǎn)錄因子參與了該過(guò)程的調(diào)控。AMPK-FOXO信號(hào)通路可能是減少體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的重要防御機(jī)制，是治療代謝綜合征心血管疾病的潛在治療靶點(diǎn)。 方法: 1．細(xì)胞培養(yǎng)：原代人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aortic endothelial cells，HAECs），使用內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基-2（endothelial cell growth medium-2，EG

6、M-2），在37℃和5％CO2孵育箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞被轉(zhuǎn)染siRNAs，或者被刺激以不同濃度的AICAR或者PA以構(gòu)建細(xì)胞模型。 2．脂肪酸白蛋白復(fù)合物的配制：將可溶性棕櫚酸（PA）溶解在200mM的酒精當(dāng)中，并與10％的無(wú)游離脂肪酸，低內(nèi)毒素的BSA混合，使其終濃度在1-5mM。所有溶液的PH值調(diào)整在7．5左右，使用濾器消毒，-20℃儲(chǔ)存。將不含有PA的BSA溶液作為對(duì)照。在處理細(xì)胞之前，將儲(chǔ)存的PA按照1：10的比例，使用培

7、養(yǎng)基進(jìn)行稀釋。 3．siRNA誘導(dǎo)的基因沉默：使用特異的siRNA進(jìn)行基因沉默，包括AMPK siRNA，Trx siRNA和FOXO3a siRNA。使用LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體包裹，并轉(zhuǎn)染HAECs。被轉(zhuǎn)染的HAECs細(xì)胞，再使用PA和AICAR等進(jìn)行處理。 4．質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染：分別使用0．5μg野生型FOXO3表達(dá)質(zhì)粒（HA-FOXO3aWT），負(fù)顯性型FOXO3a表達(dá)質(zhì)粒（dominant-

8、negative HA-FOXO3a TM delta DM，DN）和持續(xù)激活型FOXO3a表達(dá)質(zhì)粒（constitutively active HA-FOXO3a TM，CA）處理內(nèi)皮細(xì)胞。首先使用LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體包裹，并轉(zhuǎn)染HAECs。被轉(zhuǎn)染的HAECs細(xì)胞，再使用PA和AICAR等進(jìn)行處理。 5．免疫熒光染色：將處理好的細(xì)胞使用含有一抗1％BSA進(jìn)行孵育，并用得克薩斯紅標(biāo)記的二抗進(jìn)行處理。使用D

9、API染核，裝備有Leica DC100數(shù)字相機(jī)的Leic DMLS熒光顯微鏡采集圖像。應(yīng)用Image-Pro Plus V4．5分析軟件進(jìn)行分析。 6．蛋白印跡分析：使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞的總蛋白。將含有15μg微粒蛋白的每個(gè)標(biāo)本和蛋白Marker一起分別加入不同的泳道。在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳移動(dòng)，再用一濕電轉(zhuǎn)染儀電轉(zhuǎn)染到聚偏氟乙烯膜（PVDF）上。將膜封閉后，使用一抗孵育，清洗后，再使用HRP結(jié)合的二抗孵育。滴

10、加顯色液顯色。強(qiáng)弱用表達(dá)的蛋白和β-actin條帶積分光密度的比值表示。 7．實(shí)時(shí)定量PCR：使用Trizol提取細(xì)胞的總RNA。應(yīng)用iScript cDNA合成酶將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用iCycler iQ熒光探針系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR。采用Trx與β-actin的循環(huán)閾值（threshold cycle，Ct）的比值并通過(guò)公式2ΔCt（△Ct=β-actinCt-gene of interest Ct）表示mRNA的相對(duì)

11、水平。 8．細(xì)胞內(nèi)ROS的檢測(cè)：應(yīng)用CM-H2DCFDA熒光探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。使用裝備有Leica DC100數(shù)字相機(jī)的Leic DMLS熒光顯微鏡采集圖像。應(yīng)用Image-Pro Plus V4．5分析軟件進(jìn)行分析。 9．Trx活性分析：采用胰島素二硫還原法分析Trx的活性。應(yīng)用412 nm的吸收光譜進(jìn)行測(cè)量。Trx活性使用與對(duì)照組的相對(duì)比值進(jìn)行表示。 10．染色質(zhì)免疫沉淀分析：我們使用Upstate公

12、司生產(chǎn)的染色質(zhì)免疫沉淀分析試劑盒。首先將處理過(guò)的HAECs用甲醛孵育，以形成DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。應(yīng)用特異抗體-蛋白A-瓊脂糖漿對(duì)DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體進(jìn)行免疫沉淀（IgG作為陰性對(duì)照）。將這些免疫復(fù)合物珠子進(jìn)行清洗，洗脫和解鏈。使用苯酚/氯仿/易戊酯酒精混合物萃取DNA片段。然后，將免疫沉淀的DNA片段作PCR，使用1．5％的瓊脂糖膠分離PCR產(chǎn)物。 11．免疫沉淀分析：將處理過(guò)的細(xì)胞在冰上裂解60分鐘。細(xì)胞裂解液與抗體和蛋白A

13、/G-瓊脂糖珠子共同孵育4℃過(guò)夜以進(jìn)行免疫沉淀。使用提取液清洗珠子兩遍，然后再使用含有0．5 M氯化鋰的提取液清洗兩遍。使用SDS樣本試劑直接洗脫蛋白質(zhì)，然后進(jìn)行蛋白印跡分析。 12．激酶活性分析：使用AMPK特異性抗體將AMPK從細(xì)胞裂解液中沉淀出來(lái)。并將含AMPK的免疫磁珠與重組FOXO3在含有100μM ATP的激酶活性分析液中孵育20分鐘，溫度控制在30℃。將樣本跑膠轉(zhuǎn)膜，使用抗蘇氨酸和絲氨酸抗體進(jìn)行標(biāo)記。 結(jié)論

14、: 1．PA能顯著的增加人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平。 2．AMPK激活可通過(guò)上調(diào)Trx表達(dá)顯著降低PA所致的細(xì)胞內(nèi)ROS的升高。 3．轉(zhuǎn)錄因子FOXO3a介導(dǎo)了AMPK對(duì)Trx的調(diào)節(jié)。 4．AMPK通過(guò)增加FOXO3a核轉(zhuǎn)位，促進(jìn)其DNA與Trx啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合而增加Trx的轉(zhuǎn)錄。 5．AMPK-FOXO3a信號(hào)通路對(duì)代謝應(yīng)激下細(xì)胞內(nèi)超氧化物水平有保護(hù)作用，是治療糖尿病心血管并發(fā)癥的潛在治療靶點(diǎn)。