I期非小細(xì)胞肺癌miRNA-34b-c編碼DNA甲基化的研究.pdf

1、目的:肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤?；颊咚劳龅闹饕蚴悄[瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移,即使Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌,也有大約30％到40％的患者死于術(shù)后的腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。因此,對(duì)肺癌的診斷和預(yù)后評(píng)判的分子標(biāo)志物及分子分期越來越受到研究者的重視。miRNA表達(dá)譜可以作為肺癌的診斷和預(yù)后分子標(biāo)志物。最近的研究顯示,miRNA-34家族表達(dá)受p53轉(zhuǎn)錄活性和DNA甲基化狀態(tài)的直接調(diào)控。本研究的目的是miRNA-34家族的DNA甲基化與Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌

2、術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性。
　　 方法:1999至2005年,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院胸外科共收治非小細(xì)胞肺癌患者4702例,其中833例患者術(shù)后病理論斷為Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌,占全部病例的17.72％。入組本研究的所有Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者術(shù)前及術(shù)后復(fù)發(fā)前均未進(jìn)行輔助放化療及生物治療,圍手術(shù)期死亡患者及術(shù)后非腫瘤原因死亡患者均未納入本研究。共有161例符合本研究的入組條件。且可以從病理科獲得石蠟包埋腫瘤組織,所有患者均隨訪滿5年,術(shù)后復(fù)發(fā)病例

3、均有明確影像學(xué)或病理學(xué)證據(jù),死亡病例均是死于腫瘤及腫瘤引起的并發(fā)癥。
　　 161例Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌的石蠟包埋腫瘤組織樣本被納入此研究,通過巢式甲基化特異PCR的方法,我們檢測(cè)了其miR-34a與miR-34b/c的DNA甲基化狀態(tài)。另外,通過相對(duì)定量RT-PCR的方法,我們檢測(cè)了這批樣本的成熟miR-34b與miR-34c的表達(dá)水平。
　　 所有的統(tǒng)計(jì)分析都使用SPSS13.0軟件進(jìn)行。臨床因素(性別,年齡,分期,病理

4、類型,手術(shù)方法,吸煙史及腫瘤家族史)與腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性采用Chi-square t檢驗(yàn),同樣的方法用于分析miR-34a及miR-34b/c甲基化狀態(tài)與腫瘤復(fù)發(fā)的相關(guān)性。多因素logistic回歸模型用于檢驗(yàn)miR-34b/c甲基化狀態(tài)與臨床因素的關(guān)系。通過log-rank檢驗(yàn)的Kaplan-Meier方法比較總生存時(shí)間與無病生存時(shí)間。Cox回歸模型,用于檢驗(yàn)總生存時(shí)間和無病生存時(shí)間與臨床因素及miR-34b/c甲基化狀態(tài)的相關(guān)性。甲基

5、化組及非甲基化組的miR-34b/c的表達(dá)水平,通過非配對(duì)Wilcoxon(Mann-Whitney)檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:全部161例樣本DNA經(jīng)重亞硫酸鹽修飾后,通過巢式MSP進(jìn)行擴(kuò)增。其中98.1％(158/161)可以擴(kuò)增出miR-34a,96.9％(156/161)可以擴(kuò)增出miR-34b/c。對(duì)于miR-34a,其啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化率在復(fù)發(fā)組為39.2％(20/51),而在非復(fù)發(fā)組為3

6、5.5％(38/107)；對(duì)miR-34b/c,其啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化率在復(fù)發(fā)組為54.9％(28/51),而在非復(fù)發(fā)組為36.2％(38/105),miR-34b/c啟動(dòng)子區(qū)高甲基化與Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌術(shù)后復(fù)發(fā)有明顯相關(guān)性(p=0.026),而miR-34a與患者術(shù)后復(fù)發(fā)未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。
　　 通過分析可以擴(kuò)增出miR-34b/c的156例Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者的術(shù)后總生存時(shí)間,及無病生存時(shí)間,發(fā)現(xiàn)非甲基化組預(yù)后明顯好于甲基化組

7、患者,總生存時(shí)間(p=0.010),無復(fù)發(fā)生存時(shí)間(p=0.017)。非甲基化組與甲基化組的術(shù)后中位總生存時(shí)間分別為56個(gè)月與51個(gè)月；非甲基化組與甲基化組的術(shù)后中位無復(fù)發(fā)生存時(shí)間分別為52個(gè)月與48個(gè)月。多因素回歸分析顯示,miR-34b/c甲基化狀態(tài)是獨(dú)立于分期,分化,病理類型,吸煙史等臨床因素的總生存及無復(fù)發(fā)生存獨(dú)立預(yù)后因素。
　　 采用相對(duì)定量RT-PCR的方法,檢測(cè)了可以擴(kuò)增出miR-34b/c的156例Ⅰ期非小細(xì)胞肺

8、癌組織樣本的成熟miR-34b與miR-34c的表達(dá)水平。成熟miR-34b在甲基化組的中位相對(duì)表達(dá)水平為1.59,在非甲基化組的中位相對(duì)表達(dá)水平為1.85；成熟miR-34c在甲基化組的中位相對(duì)表達(dá)水平為1.64,在非甲基化組的中位相對(duì)表達(dá)水平為1.78。顯示miR-34b/c啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)其成熟序列表達(dá)無影響。
　　 通過定量RT-PCR方法檢測(cè)了成熟miR-34b與miR-34c相對(duì)表達(dá)水平后,我們分析了其水平與Ⅰ期非小

9、細(xì)胞肺癌術(shù)后生存的關(guān)系。在全部156例樣本中成熟miR-34b的中位相對(duì)表達(dá)水平為1.72,據(jù)此將156例樣本分為兩組:相對(duì)表達(dá)大于1.72為miR-34b高表達(dá)組,相對(duì)表達(dá)低于1.72為miR-34b低表達(dá)組；同樣地,在全部156例樣本中成熟miR-34c的中位相對(duì)表達(dá)水平為1.76,據(jù)此將156例樣本分為兩組:相對(duì)表達(dá)大于1.76為miR-34c高表達(dá)組,相對(duì)表達(dá)低于1.76為miR-34c低表達(dá)組。通過log-rank檢驗(yàn)的Kap

10、lan-Meier方法比較總生存時(shí)間與無復(fù)發(fā)生存時(shí)間,我們發(fā)現(xiàn)成熟miR-34b與miR-34c相對(duì)表達(dá)水平與Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌術(shù)后總生存時(shí)間及無復(fù)發(fā)生存時(shí)間無顯著相關(guān)性。
　　 結(jié)論:miR-34b/c甲基化狀態(tài)與Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌術(shù)后生存相關(guān)。miR-34b/c的DNA甲基化是Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌的獨(dú)立預(yù)后因素,miR-34b/c的DNA甲基化可以作為判斷Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。
　　 miR-34a的DNA甲