食管癌相關(guān)miRNA基因DNA甲基化狀態(tài)的初步研究.pdf

1、食管癌是人類常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,全世界每年約30萬(wàn)人死于食管癌,其中70％發(fā)生在我國(guó),其中食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)約占病例總數(shù)的90％以上。因早期癥狀不明顯并且缺乏有效的治療措施,大部分食管癌患者就診時(shí)已是中晚期,此時(shí)手術(shù)切除治療的5年生存率僅為25％左右,是高致死性的疾病。因此尋找新的診斷治療靶點(diǎn)對(duì)食管癌的早期診斷、治療、預(yù)后以及預(yù)防具有重要的臨床意義。
　

2、　 DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一,主要發(fā)生于基因啟動(dòng)子附近的CpG島。在許多人類腫瘤中都可以發(fā)現(xiàn)不同程度的DNA異常甲基化現(xiàn)象,表現(xiàn)為基因組整體甲基化水平降低,抑癌基因調(diào)控區(qū)域甲基化水平升高。目前認(rèn)為,啟動(dòng)子區(qū)CpG島超甲基化導(dǎo)致抑癌基因去表達(dá)是腫瘤中主要的表觀遺傳(epigenetics)改變之一,在許多惡性腫瘤的癌前病變中都發(fā)現(xiàn)了多個(gè)抑癌基因的CpG島高甲基化。研究發(fā)現(xiàn),食管癌癌變過(guò)程中抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域CpG島的甲基

3、化呈漸進(jìn)性改變,啟動(dòng)子區(qū)CpG島高甲基化在腫瘤的早期階段、癌前階段已存在,發(fā)生在細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變之前,所以對(duì)基因甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè),有望發(fā)現(xiàn)食管癌發(fā)生早期的生物標(biāo)志。
　　 MicroRNA是一類21-25個(gè)堿基的小分子非編碼RNA,存在于各種真核生物中。MicroRNA主要通過(guò)促進(jìn)靶mRNA的降解或抑制其翻譯過(guò)程而發(fā)揮調(diào)控作用,廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、代謝及分化等過(guò)程。MicroRNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及演進(jìn)有著極為密

4、切的關(guān)系。Guo等通過(guò)芯片檢測(cè)到在食管鱗癌中46種miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)與癌旁正常組織具有顯著性差異,表明miRNA在食管癌的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。與其它基因一樣,腫瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)受到包括DNA甲基化修飾在內(nèi)的多種機(jī)制的調(diào)控,而且miRNA基因甲基化狀態(tài)的變化和腫瘤的類型及臨床表型有關(guān)。由于不同組織來(lái)源的腫瘤存在各自特征性的miRNA表達(dá)譜,其甲基化狀態(tài)既有共性也有各自的特性。迄今為止,還沒(méi)有關(guān)于食管癌中相關(guān)miRN

5、A的CpG島甲基化狀態(tài)的研究報(bào)道。
　　 因此,針對(duì)食管癌這一我國(guó)高發(fā)的惡性腫瘤,我們根據(jù)以往的研究資料,對(duì)在食管癌表達(dá)有差異的miRNA基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)miR-34a、miR-34b/c、miR-424、miR-129-2的啟動(dòng)子區(qū)或周圍都有CpG島。食管癌中上述miRNA基因區(qū)域的甲基化狀態(tài)是否具有特征性改變?成為本課題重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。本研究將通過(guò)檢測(cè)食管癌病例中miRNA的CpG甲基化狀態(tài),以期找到和食管癌相關(guān)

6、的、潛在的早期診斷標(biāo)志物。
　　 此外,miRNA-34是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有抑癌基因樣功能的重要調(diào)控因子,是p53的靶基因,它的上調(diào)引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡,參與傳統(tǒng)的P53的抑癌網(wǎng)絡(luò)。miRNA在不同腫瘤中的表達(dá)改變具有細(xì)胞組織的差異,同時(shí)也與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展的進(jìn)程相關(guān)。因此,本研究將進(jìn)一步明確在食管癌中,CpG甲基化改變是否參與miR-34表達(dá)的調(diào)控,在此基礎(chǔ)上,嘗試探討干預(yù)甲基化狀態(tài)對(duì)miR-34表達(dá)及其靶基因的影響,為以后

7、進(jìn)一步將miRNA分子作為早期干預(yù)治療的靶點(diǎn)提供線索。
　　 第一部分腫瘤相關(guān)miRNA基因的CpG島甲基化狀態(tài)與食管癌的相關(guān)性
　　 研究方法:通過(guò)生物信息學(xué)分析和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘,選取啟動(dòng)子區(qū)域具有CpG島的腫瘤相關(guān)miRNA分子miR-34a、miR-34b/c、miR-424、miR-129-2為研究對(duì)象。采用BSP和MSP的方法檢測(cè)食管癌腫瘤組織、遠(yuǎn)癌組織、食管癌細(xì)胞株(KYSE150、KYSE450、EC109

8、、EC9706)的甲基化狀態(tài)。
　　 研究結(jié)果:miR-424在腫瘤組織/細(xì)胞株和遠(yuǎn)癌組織中都是甲基化的,沒(méi)有差異。食管癌細(xì)胞株(ECl09、EC9706、KYSE450、KYSE150)中miR-34a、miR-34b/c、miR424、miR129-2都是甲基化的。腫瘤組織中的甲基化率miR-34a為66.7％(36/54),miR-34b/c為40.7％(22/54),miR129-2為100％(27/27);遠(yuǎn)癌組織中m

9、iR-34a為26.7％(8130),miR-34b/c為0(0/30),miR129-2為0(0/13),經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明三種miRNA在腫瘤組織和細(xì)胞株中的甲基化率顯著高于遠(yuǎn)癌組織。miR-34a和miR-34b/c的甲基化率與腫瘤的分化情況、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等臨床表型參數(shù)無(wú)關(guān)(p＞0.05)。其中miR-129-2在檢測(cè)的27例食管癌中全部甲基化而遠(yuǎn)癌組織沒(méi)有甲基化,提示miR-129-2的甲基化狀態(tài)可能成為食管癌細(xì)胞的特

10、征性標(biāo)志,可能成為潛在的早期診斷靶點(diǎn)。
　　 第二部分 DNA甲基化對(duì)食管癌miR-34表達(dá)及其靶基因的影響
　　 研究方法:
　　 1.選擇miR-34為進(jìn)一步研究靶點(diǎn),TaqMan Real-time PCR方法檢測(cè)24例腫瘤組織的miR-34的表達(dá)情況,比較甲基化組和非甲基化組miR-34的表達(dá)差異。
　　 2.利用去甲基化試劑5-Aza-CdR處理食管癌細(xì)胞株KYSE150、KYSE450,采用甲

11、基化特異性PCR(MSP)檢測(cè)甲基化逆轉(zhuǎn)情況,Real-time PCR檢測(cè)用藥前后miR-34的表達(dá)。
　　 3.Western Blot免疫印跡法檢測(cè)食管癌細(xì)胞株5-Aza-CdR處理前后miR-34a靶基因Bcl-2的表達(dá)變化情況。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.24例食管癌腫瘤組織中,甲基化組miR-34a、miR-34b的表達(dá)水平顯著性低于非甲基化組。(p＜0.05)
　　 2.甲基化酶抑制劑5-

12、Aza-CdR處理食管癌細(xì)胞株后,MSP分析發(fā)現(xiàn)miR-34-a,b啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生去甲基化,Real-time PCR檢測(cè)處理前后miR-34的表達(dá),結(jié)果顯示miR-34的表達(dá)隨著甲基化狀態(tài)的丟失而上調(diào)。
　　 3.Western Blot免疫印跡法分析顯示,未加藥處理的KYSE150、KYSE450細(xì)胞株在分子量為26KD的位置均有明顯條帶;而5-Aza-CdR處理的KYSE150沒(méi)有條帶,KYSE450的條帶較其未加藥處理前