二苯乙烯苷對糖尿病腎病的作用及初步機制研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病有多種并發(fā)癥，糖尿病腎病(DiabetienePhroPathy，DN)是其中最常見的一種，也是患者的重要死亡原因。由于2型糖尿病的起病比較隱匿，大多數(shù)患者往往不能及時發(fā)現(xiàn)，據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計，有5％的患者在診斷糖尿病時就發(fā)現(xiàn)已經(jīng)伴有DN的腎臟損傷。而且，當(dāng)患者在臨床上表現(xiàn)出相關(guān)癥狀時，其死亡率明顯增加，而且治療十分困難。因此，DN也就成為了當(dāng)今世界糖尿病領(lǐng)域研究的熱點和難點。隨著DN的發(fā)病率不斷升高和社會人口的老齡化，

2、這個數(shù)據(jù)還會不斷升高。另有研究表明，在這些終末期的腎臟疾病患者中，約有40％是由DN導(dǎo)致的，每年新增終末期腎病患者中由DN引發(fā)的高達50％以上。我國DN的發(fā)生率約為34.7％，已成為慢性腎功能衰竭的主要原因，其危害不容忽視。DN的病理機制是一個動態(tài)的發(fā)展過程，整個疾病的病程長，并且有大量的研究成果表明DN是多種因素作用的結(jié)果，在臨床治療上存在一定的困難。DN的臨床表現(xiàn)變化復(fù)雜，欠期甚至沒有臨床癥狀，晚期可導(dǎo)致終末期腎病的謝紊亂。目前，治

3、療 DN的的方法大都是健康療法，并且以預(yù)防為主，對其病機不同學(xué)者觀點有所差異，各有側(cè)重。其中，中藥防治DN作用機制的實驗研究受到廣泛關(guān)注。為了更好且有效地解決這一難題，進一步深入研究其意義深遠(yuǎn)。所以，我們通過進一步的深化研究中藥對 DN的作用機制，為闡明DN的發(fā)病機制，篩選出有效的藥物進行深化的研究以及提出科學(xué)的依據(jù)。
　　DN的發(fā)病機制尚未完全闡明?，F(xiàn)今實驗研究結(jié)果表明，DN與糖脂代謝紊亂，氧化應(yīng)激反應(yīng)，血管活性物質(zhì)，血流動力學(xué)

4、改變等多種因素有關(guān)，從而引起慢性腎臟損傷。隨著人們對氧化應(yīng)激反應(yīng)在DN發(fā)病機制中的重要性的深入研究，氧化應(yīng)激反應(yīng)在對DN的研究越來越受到重視，而抗氧化也成了治療DN的新靶點和新熱點。二苯乙烯苷（TSG）是我國傳統(tǒng)中藥何首烏中提取的一種具有顯著藥理活性的水溶性成分。目前，大量文獻和研究成果表明，TSG在治療多種疾病時都參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)，且具有抗衰老、抗炎、抗菌、抗氧化、抗動脈粥樣硬化等作用，但是否對DN具有良好的治療效果尚未見文獻報道。

5、據(jù)此，我們提出假說：TSG可能通過調(diào)節(jié)動物體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，提高機體的抗氧化性，從而達到治療DN的目的。為證實此假說，本課題擬采用雄性大鼠和大鼠腎小球系膜細(xì)胞模型探討TSG對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的DN大以及高糖環(huán)境下大鼠腎小球系膜細(xì)胞的氧化應(yīng)激作用及其機制。
　　方法：
　　1.動物模型的制作與用藥
　　選取體重為250g-280g的SD大鼠作為實驗對象，所有動物均采用普通大鼠專用飼料喂養(yǎng)，隨意飲水，攝食，室溫控制在25℃

6、左右，濕度70%，12小時交替照明。將60只大鼠隨機分為正常對照組10只、DN模型組50只。大鼠實驗前禁食12小時(不禁水)，將鏈脲佐菌素溶于pH4.4檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液中，按50mg/kg一次性腹腔內(nèi)注射，3天后檢測動物的血糖濃度大于16.7mmol/L，尿糖陽性，確定為糖尿病成型；動物繼續(xù)糖尿病成模4周后，使用尿液分析儀檢測尿液生化指標(biāo)，尿蛋白明顯增加，說明DN模型成功。選取造模成功大鼠按照體重區(qū)段隨機分為5組，分別為模型組（生理

7、鹽水5mL/kg,2次/天，ip.），厄貝沙坦（厄貝沙坦片，6mg/kg，ip.），TSG低劑量組（20mg/kg，ip.），TSG中劑量組（40mg/kg,2次/天，ip.），TSG高劑量組（60mg/kg，2次/天，ip.）。
　　2.DN大鼠血和尿生化指標(biāo)的檢測
　　分別在給藥后第2、4、6周，用取血針從尾部取血檢測血糖；分別在給藥后第2、4、6周，大鼠麻醉，眼眶取血1.5mL，離心取上層血清；實驗結(jié)束前，通過腹腔取血

8、的方法收集血液并離心取上層血清。使用全自動生化分析儀測定血清中高密度脂蛋白，低密度脂蛋白，糖化血清蛋白，血尿素氮，血肌酐等的表達水平；用比色法檢測試尿中總蛋白的含量。
　　3.大鼠腎小球系膜細(xì)胞的培養(yǎng)及周期和凋亡的檢測
　　將凍存的細(xì)胞快速放入37℃的水浴中，輕搖凍存管，使其在一分鐘內(nèi)全部融化，將融化的細(xì)胞離心后棄上清，加入含10％FBS和雙抗的高糖培養(yǎng)基反復(fù)吹打，通過顯微鏡觀察，當(dāng)細(xì)胞均勻的懸浮在培養(yǎng)基中進行細(xì)胞傳代，并觀

9、察其細(xì)胞形態(tài)，將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞帖壁后，向培養(yǎng)板中加入不同濃度的TSG，采用MTT進行細(xì)胞增殖分析；采用流式細(xì)胞儀檢測在不同濃度的藥物干預(yù)下，大鼠腎小球系膜細(xì)胞的周期變化和凋亡變化。
　　4.TSG對DN大鼠血清中氧化應(yīng)激指標(biāo)的檢測
　　DN大鼠的血液通過離心后取血清；采用氧化應(yīng)激指標(biāo)試劑盒，通過全自動生化儀進行分析，測定出不同濃度的TSG對DN大鼠血清中NO、NOS、MDA、SOD等指標(biāo)的影響

10、；在通RT-PCR及Western blot方法檢測血清中相關(guān)蛋白的表達。
　　5.TSG對DN大鼠組織中抗氧化酶基因HO-1，γ-GCS表達蛋白表達的影響
　　給藥8周后，取出處死大鼠的腎臟，稱重，檢測不同組大鼠的腎重系數(shù)；將稱重過的組織部分進行勻漿，通過Western blot法檢測不同給藥濃度腎臟組織中抗氧化酶基因HO-1，γ-GCS表達等蛋白的表達。
　　結(jié)果：
　　1.TSG能夠明顯改善DN大鼠的腎臟損

11、傷
　　通過 DN大鼠的血清生化指標(biāo)結(jié)果顯示，模型組大鼠與正常組大鼠相比，血糖明顯升高，血清中各項指標(biāo)明顯異常，出現(xiàn)三多一少癥狀，死亡率升高，通過對模型組大鼠進行TSG藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)TSG可以明顯降低DN大鼠血糖，改善模型組大鼠血生化指標(biāo)異常，降低死亡率；通過稱量大鼠的體重和腎臟重量，發(fā)現(xiàn)TSG可以明顯降低DN大鼠的腎重系數(shù)；在細(xì)胞實驗中，通過MTT結(jié)果和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果我們不難發(fā)現(xiàn)，TSG可以改變高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞的周期和凋

12、亡，減少高糖對細(xì)胞的損傷。
　　2.TSG改善體內(nèi)及細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)
　　氧化應(yīng)激試劑盒、RT-PCR和Western Blot的檢測結(jié)果證實TSG確實可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。實驗結(jié)果顯示，TSG可以明顯的改善動物血清和細(xì)胞上清中氧化應(yīng)激指標(biāo)。
　　3.TSG對DN大鼠的腎組織及腎小球系膜細(xì)胞凋亡的保護
　　通過Western blot法檢測不同給藥濃度腎臟組織中和細(xì)胞上清中Nrf2蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)各組大鼠

13、腎組織和細(xì)胞上清中均有表達，其中DN組的蛋白表達明顯高于其他組；通過電鏡觀察，發(fā)現(xiàn) DN組大鼠的腎組織細(xì)胞中有大量的系膜細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)向邊緣靠攏，聚集成團等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，而在TSG干預(yù)后，這種凋亡現(xiàn)象有明顯好轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：
　　TSG能夠有效降低DN大鼠血糖，抑制DN大鼠腎小球系膜細(xì)胞增生，改善血清中各項生化指標(biāo)，對DN大鼠腎臟具有保護作用。
　　Nrf2蛋白通路參與了DN腎臟組織中細(xì)胞的凋亡，TSG通過抑制Nrf2