腎康注射液對(duì)糖尿病腎病的作用及初步機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:
　　1、對(duì)常用DN大鼠模型的建立方法進(jìn)行篩選并優(yōu)化,為SKI防治DN藥效學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。
　　2、采用大鼠DN模型及體外細(xì)胞模型,評(píng)價(jià)SKI對(duì)DN的治療作用并探討其作用機(jī)制,為SKI的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。
　　3、對(duì)SKI中大黃蒽醌成分進(jìn)行定性、定量分析為揭示其物效機(jī)制及二次開(kāi)發(fā)提供依據(jù);觀測(cè)SKI中主成分(大黃素、大黃酸)對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的作用,明確SKI的功效成分,揭示其可能的作用機(jī)制。
　　研

2、究方法:
　　一、DN動(dòng)物模型的研究
　　(1)采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)I型DN大鼠模型并分別對(duì)STZ的使用劑量進(jìn)行篩選。
　　(2)采用高脂飼料聯(lián)合STZ30 mg/kg體重建立II型DN大鼠模型并分別對(duì)高脂飼料使用周期進(jìn)行探討。
　　(3)采用單側(cè)腎切除或單側(cè)腎結(jié)扎并聯(lián)合STZ30 mg/kg體重建立DN大鼠模型并對(duì)腎結(jié)扎與切除兩種方法進(jìn)行探討。
　　二、SKI對(duì)DN大鼠的作用及機(jī)制研究

3、r>　　(1)采用腹腔注射STZ65 mg/kg建立SD大鼠I型DN模型及高脂飼料飼養(yǎng)4周并聯(lián)合腹腔注射STZ30 mg/kg建立SD大鼠II型DN模型。將DN模型大鼠隨機(jī)分成腎康高劑量組(給予SKI10 mL/kg,2次/d,i.p.);腎康中劑量組(給予SKI5 mL/kg,2次/d,i.p.);腎康低劑量組(給予SKI2.5 mL/kg,2次/d,i.p.);在I型DN大鼠實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性藥物胰島素組(10 U/kg,2次/天,i.m)

4、,在II型DN大鼠實(shí)驗(yàn)中陽(yáng)性藥物胰島素組(4 U/kg,2次/天,i.m);模型組(生理鹽水,5 mL/kg,2次/d,i.p.)。設(shè)置正常組給予生理鹽水(5 mL/kg,2次/d,i.p.)。分別于給藥前及給藥后第2、4、8周眼底靜脈叢取血檢測(cè)血肌酐、尿素氮、甘油三酯、糖化血紅蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等生化指標(biāo)。第8周,取1 mL血于肝素抗凝管內(nèi),于4℃冷凍離心機(jī)2000轉(zhuǎn)/分,離心10 min,后取上清;分別檢測(cè)血清中T-S

5、OD、CAT、NO、NOS及MDA;動(dòng)物處死取腎臟稱重、定點(diǎn)取材實(shí)施腎臟組織病理學(xué)檢查。
　　(2)采用高糖(含葡萄糖25 mmol/L)培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞建立DN細(xì)胞模型并分為腎康高劑量組(高糖培養(yǎng)基含SKI100 mg/L);腎康中劑量組(高糖培養(yǎng)基含SKI50 mg/L);腎康低劑量組(高糖培養(yǎng)基含SKI25 mg/L)。并設(shè)置低糖組(含葡萄糖5.6 mmol/L)及甘露醇組(低糖培養(yǎng)基+19.6 mmol/L甘露醇)。探討

6、SKI對(duì)高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞的抑制作用。
　　三、SKI中大黃蒽醌類(lèi)成分的定性、定量分析及活性研究
　　(1)通過(guò)三氯甲烷多次萃取SKI中大黃蒽醌成分進(jìn)行定性、定量分析,并采用島津LC2010-AT高效液相色譜儀;色譜柱為StamsiL-BP C18(250 mm×4.6,5μm);流動(dòng)相:A(甲醇)-B(0.2％磷酸水溶液),梯度洗脫0-25 min,A:75%-100%;檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm;柱溫:30℃;流速1 m

7、L/min;進(jìn)樣量:20μL。
　　(2)高糖(25mmol/L葡糖糖)培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞建立DN細(xì)胞模型,分別給予大黃酸(80μmmol/L,40μmmol/L,20μmmol/L)及大黃素(80μmmol/L,40μmmol/L,20μmmol/L);采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、透射電鏡和western blot方法,檢測(cè)或觀察大黃素和大黃酸分別對(duì)系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡、細(xì)胞結(jié)構(gòu)以及bax、
　　caspase-3、c

8、aspase-6、caspase-8蛋白表達(dá)等影響。
　　結(jié)果及結(jié)論:
　　采用腹腔注射STZ65 mg/kg體重建立大鼠I型DN模型,模型成功率高,且對(duì)動(dòng)物損傷小;高脂飼料飼養(yǎng)4周聯(lián)合腹腔注射STZ30 mg/kg體重建立大鼠II型DN模型,周期短,模型成功率高且經(jīng)濟(jì);單側(cè)腎結(jié)扎聯(lián)合腹腔注射STZ30 mg/kg建立DN大鼠模型對(duì)動(dòng)物損傷小,動(dòng)物死亡率相對(duì)較低。
　　SKI各劑量組均明顯降低血肌酐、尿素氮、甘油三酯、

9、低密度脂蛋白的含量(P<0.05);升高DN大鼠血中高密度脂蛋白含量(P<0.05);顯著抑制腎臟肥大(P<0.05)。與模型組比較,SKI顯著升高血清中T-SOD、CAT活力(P<0.05);明顯降低血清中NO、NOS及MDA含量(P<0.05)。腎組織病理學(xué)檢查證實(shí),SKI各劑量組均能明顯改善腎臟損傷,緩解腎小球硬化及間質(zhì)纖維化。體外研究證實(shí)SKI能夠顯著抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖,促進(jìn)系膜細(xì)胞凋亡,影響系膜細(xì)胞周期中DNA合成階段。<

10、br>　　SKI中五種蒽醌類(lèi)成分的含量順序?yàn)樘J薈大黃素>大黃素>大黃酸>大黃酚>大黃素甲醚。通過(guò)對(duì)三批次含量分析證實(shí)蘆薈大黃素的含量為23.20±1.36μg/mL,大黃酸為11.19±2.00μg/mL,大黃素為12.50±2.49μg/mL;大黃酚為7.10±1.49μg/mL;大黃素甲醚為1.51±0.21μg/mL。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大黃素和大黃酸各濃度組均能明顯抑制高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細(xì)胞增殖,其機(jī)制可能與抑制腎小球系膜細(xì)胞周期、促