人iPS細胞的誘導及誘導體系的優(yōu)化.pdf

1、 碩士學位論文 碩士學位論文 論文題目 論文題目： 人 iPS 細胞的誘導及誘導體系的優(yōu)化 英文題目 英文題目： The induction of human induced pluripotent stem cells and optimization of inducing system 學 位 類 學 位 類 別： 理學碩士 研 究 生 姓

2、研 究 生 姓 名： 程騰 學號 學號：201102175 學科 學科(領域 領域)名稱 名稱： 生物化學與分子生物學 指 導 教 指 導 教 師： 馬利兵 職稱 職稱： 教授 協(xié)助指導教 協(xié)助指導教師： 賀小英 職稱 職稱： 講師 2014 年 6 月 7 日 分類號 分類號： Q2 Q2 密 級： 公開 公開 U D C ： 學校代碼 學校代碼： 101

3、27 10127 內蒙古科技大學碩士學位論文 I 摘 要 iPS 細胞(induced pluripotent stem cells, iPS 細胞)，即誘導多潛能干細胞，是通過向終末分化的體細胞中導入某些基因(Sox2、Oct4、c-Myc 和 Klf4)，使其逆向回到胚胎干細胞樣狀態(tài)。它的特征和胚胎干細胞(embryonic stem cells, ESCs)一致，能夠分化成多種類型細胞。 本 論 文 中 ， 通 過 磷

4、 酸 鈣 法 和 QuickShuttle 轉 染 試 劑 對 慢 病 毒 載 體(FU-tet-o-hSox2 、 FU-tet-o-hOct4 、 FU-tet-o-hc-Myc 、 FU-tet-o-hKLF4 、FUdeltaGW-rtTA)和逆轉錄病毒載體 pEYK?E4 進行病毒包裝并測定病毒滴度， 同時優(yōu)化了其轉染條件；對人胎兒成纖維細胞(human fetus fibroblast cells, hFFCs)進行了原代和

5、傳代培養(yǎng)， 并對不同原代培養(yǎng)方法進行了比較； 對小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonal fibroblasts, MEFs)進行了原代和傳代培養(yǎng)，并將其用絲裂霉素 C 處理制備飼養(yǎng)層，將 hFFCs 用病毒感染并觀察其形態(tài)變化，之后將其接種到飼養(yǎng)層上，每天換液觀察直至克隆出現。本論文對人 iPS 細胞的誘導體系進行了一系列優(yōu)化，提供了一個操作簡單，無需復雜儀器，花費不高的方案，具體研究內容及結果如下： 采用磷酸鈣法和 Qui

6、ckShuttle 轉染試劑對慢病毒載體(FU-tet-o-hSox2、FU-tet-o-hOct4、FU-tet-o-hc-Myc、FU-tet-o-hKLF4、FUdeltaGW-rtTA)和逆轉錄病毒載體 pEYK?E4 進行病毒包裝并測定病毒滴度，同時研究不同包裝體系、不同轉染時間、 有無明膠包被三個方面對使用磷酸鈣法制備病毒和 QuickShuttle 轉染試劑制備病毒的影響。 從以上三方面設計正交實驗摸索最優(yōu)轉染條件。 結果

7、表明，不論是通過磷酸鈣法制備病毒還是 QuickShuttle 轉染試劑制備病毒，使用pLP1、pLP2 和 pLP/VSVG 的 3 質粒包裝體系，并將轉染的 293T 細胞鋪在用明膠包被的培養(yǎng)皿上，然后轉染 72 h 可獲得較理想的結果，其中，磷酸鈣轉染法獲得的病毒滴度為 600 TU/mL，QuickShuttle 試劑轉染法獲得的病毒滴度可達7130000 TU/mL。 使用單細胞培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)了 hFFCs 和