基于功能化材料的磷酸化與糖基化蛋白質(zhì)高效富集及鑒定新方法研究.pdf

1、蛋白質(zhì)組學(xué)以大規(guī)模分析細(xì)胞或生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)為目的，主要開展表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)兩類研究工作。生物體內(nèi)蛋白質(zhì)種類繁多，性質(zhì)復(fù)雜，數(shù)量龐大，尤其是蛋白質(zhì)翻譯后修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等現(xiàn)象的存在，對現(xiàn)行的蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法和技術(shù)提出了嚴(yán)竣挑戰(zhàn)。因此，發(fā)展更多的蛋白質(zhì)組學(xué)研究新技術(shù)與新方法，從而更好更快地進行蛋白質(zhì)體系研究，對于解決生物體生理學(xué)、病理學(xué)以及藥理學(xué)方面的重要科學(xué)問題有著重大的意義。
　　翻譯后修飾籃白質(zhì)組學(xué)

2、在現(xiàn)今蛋白質(zhì)組學(xué)中有著特殊的地位，比較常見的后修飾種類有磷酸化、糖基化、甲基化、乙?；头核鼗揎棧渲辛姿峄吞腔鞍踪|(zhì)翻譯后修飾的研究較多。規(guī)?；淖R別、檢測和鑒定生物體內(nèi)這些后修飾蛋白質(zhì)的表達(dá)及其變化，是翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)鍵技術(shù)之一。然而，磷酸化和糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究中都面臨著類似的困難，即這兩類翻譯后修飾蛋白質(zhì)的種類雖然不少，豐度卻通常較低，并且在通用的質(zhì)譜簽定中離子化效率不高，不易被質(zhì)譜識別鑒定。因此，研究磷酸化和

3、糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)，首要任務(wù)就是要將其從復(fù)雜體系中純化出來，這也是翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)之一。
　　功能化微米級和納米級材料目間在科學(xué)發(fā)肥的各個領(lǐng)域都有著很好的應(yīng)用，相對于普通材料而言，它們具有極大的比表面積和極高的表面活性，特別適于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。以這些微米或納米材料為基底，通過。些特殊的處理或者功能化基團的修飾，這些材料就能夠與一些經(jīng)過特定修飾的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，從而簡化目標(biāo)蛋白的分離純化步驟，使得后續(xù)的分析更

4、為可行。
　　本論文針對蛋白質(zhì)組學(xué)研究中面臨的磷酸化和糖基化蛋白質(zhì)高效選擇性富集方面的熱點難點問題，將功能化材料與蛋白質(zhì)分析結(jié)合起來，開展了一系列研究工作，發(fā)展了一些基于功能化材料的磷酸化和糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究新技術(shù)新方法，并利用實際生物樣品驗證了這些新技術(shù)新辦法的可行性，取得了一些創(chuàng)新性研究結(jié)果。
　　第一章概述了蛋白質(zhì)組學(xué)研究的意義和現(xiàn)狀，集中討論了磷酸化和糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究的概況、技術(shù)和方法，并就生物質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)

5、研究技術(shù)以及新興的翻譯后修飾蛋白組學(xué)中的應(yīng)用展開了一些討論，概述了功能化材料及其在生物分析中的應(yīng)用，最后提出了本論文選題的目的和意義。
　　第二章利用水熱法合成了具有多孔表面結(jié)構(gòu)的二氧化鈦微球，并將其用于鼠腦組織蛋白提取物中磷酸化肽段的富集。通過一系列的表征，確認(rèn)多孔二氧化鈦微球(直徑1微米左右)具有銳鈦礦的晶體結(jié)構(gòu)，并且其比表面積達(dá)到了84.98m2/g，是同樣粒徑的具有光滑表面的二氧化鈦微球比表面積的25倍，是商品化納米級二氧

6、化鈦材料(直徑90納米左右)比表面積的2倍。經(jīng)過條件優(yōu)化，多孔二氧化鈦材料和光滑二氧化鈦材料都成功地在標(biāo)準(zhǔn)磷酸化蛋白β-酪蛋白(β-casein)的酶解產(chǎn)物中富集到了磷酸化肽，然而當(dāng)將這兩種材料進一步應(yīng)用于較為復(fù)雜的體系，如β-casein與非磷酸化蛋白牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin，BSA)的酶解產(chǎn)物混合物中時，多孔二氧化鈦材料顯示了比光滑二氧化鈦材料更優(yōu)異的磷酸化肽選擇性。在此基礎(chǔ)上，我們還首次將三種二氧化鈦材

7、料，即多孔二氧化鈦材料、光滑二氧化鈦材料、商品化納米級二氧化鈦材料用于選擇性富集鼠腦蛋白質(zhì)提取物的酶解產(chǎn)物中的磷酸化肽段，分別分離鑒定出了223、47、90條磷酸化肽。這種多孔二氧化鈦微球合成方法簡單，成本低廉，使用靈活方便，對于磷酸化肽段的親和效果好，經(jīng)過實驗驗證，可以直接用于復(fù)雜體系中磷酸化肽段的分離。因其比表面積大，粒徑合適，也可將其裝填成親和色譜柱進行在線的磷酸化肽段或蛋白的分離富集。
　　第三章首次發(fā)展了簡便的糖基化肽段

8、靶上富集的方法用于糖基化肽段的快速分離和質(zhì)譜鑒定。首先合成了納米級金粒子，然后通過高溫煅燒將這些納米金顆粒燒結(jié)到MALDI-QIT-TOF-MS靶板上，再利用金和巰基之間的相互作用在這些納米金顆粒表面修飾上巰基苯硼酸。硼酸分子在堿性條件下會與糖分子中的順式二羥基發(fā)生可逆反應(yīng)形成一個五元環(huán)，此五元環(huán)在酸性條件下能夠解離，因此常被用來選擇性富集糖基化的肽或者蛋白質(zhì)。我們選用標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidas

9、e，HRP)、胎球蛋白(Fetuin)和去唾液酸胎球蛋白(Asialofetuin，ASF)的酶解產(chǎn)物驗證了靶板對于糖基化肽段的選擇性富集能力。在HRP濃度低至2.5×10-9 M時，仍能夠鑒定到9條糖肽或者是糖肽碎片離子的信號。不儀儀是HRP，靶上富集糖肽的方法也成功地應(yīng)用到了胎球蛋白和去唾液酸胎球蛋白酶解產(chǎn)物的糖肽富集中。為了進一步驗證這種方法的實用性，我們用靶上富集的方法對HRP與非糖基化蛋白β-casein的酶解產(chǎn)物混合液中的糖

10、肽進行了富集和鑒定，即使在HRP與β-casein的濃度比達(dá)到了1:10的條件下，也成功地從混合肽段中鑒定到了7條糖肽或糖肽碎片離子。最后，我們將HRP酶解產(chǎn)物與牛奶的酶解產(chǎn)物混合并利用靶上富集的方法對該肽段混合物進行了糖基化肽段的富集，共分離鑒定了7條HRP的糖肽或糖肽碎片離子信號。靶上富集方法快速，簡便，需要的樣品量少，易于實現(xiàn)高通量和自動化的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。存這里，我們首次發(fā)展了糖基化肽段靶上富集的方法，并通過一系列實驗驗證了該方

11、法的可行性，為糖基化蛋白質(zhì)組學(xué)研究開辟了新的道路。
　　第四章創(chuàng)新性地利用“三明治”固定方法在硼酸納米磁性微球表面固定了伴刀豆球蛋白(Concanavalin A，Con A)，并將其用于糖基化蛋白的分離富集。硼酸修飾的氨基磁球曾被成功地用于標(biāo)準(zhǔn)糖肽和標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白的富集，但當(dāng)用于實際生物樣品中的糖蛋白富集時，效率并不理想。ConA足凝集素中最常用的一種，它與甘露糖和葡萄糖殘基有著很強的親和作用，常被用來預(yù)富集生物樣品中的糖基化蛋白質(zhì)

12、。因此我們選擇Con A作為修飾物，利用硼酸和糖的共價反應(yīng)首先在氨基苯硼酸納米磁球表面修飾上一層甲基α-D-吡喃甘露糖苷，用單糖作為介質(zhì)，再利用單糖和ConA的親和作用在磁球表面固定上ConA。與在硼酸磁球表面直接固定ConA相比，利用上述“三明治”方法同定的ConA量提高了三倍。ConA納米磁球、硼酸磁球和商品化的Con A磁球(直徑1微米左右)都彼用米進行人肝痛細(xì)胞株7703細(xì)胞裂解液中糖蛋白的分離富集。利用Con A納米磁球共鑒定

13、了包含184個糖基化位點在內(nèi)的172條糖肽，這些糖肽共對應(yīng)到101個糖蛋白，占鑒定蛋白總數(shù)的約68％。利用商品化的Con A磁球其鑒定了69條糖肽，對應(yīng)于51個糖蛋白，占鑒定蛋白總數(shù)的約65％。而利用硼酸納米磁球富集后鑒定到了47個蛋白，其中只有12個是糖蛋白。ConA納米磁球制備方法簡單，成本較低，固定效率高，使用也極為方便，親和效率和商品化的ConA磁球相當(dāng)，并且由于其“三明治”法固定的第一步是利用了硼酸-單糖的可逆反應(yīng)，還能方便地