蛋白糖基化分析新方法研究.pdf

1、糖基化是真核細胞蛋白質(zhì)最常見的轉(zhuǎn)譯后修飾方式之一，連接在天冬酰胺上的稱為N-糖鏈，連接在絲氨酸或者蘇氨酸上的稱為O-糖鏈。蛋白糖基化在許多生命活動中起重要作用，包括蛋白質(zhì)折疊、細胞識別、癌細胞增殖、免疫反應(yīng)等。蛋白N糖基化分析有很多方法。最簡單的方法是酶解釋放N糖鏈后直接進行MS質(zhì)譜分析。Peptide-N-glycosidase F(PNGase F)是一種用來從蛋白或多肽上酶解沒有取代的或6位巖藻糖取代的N糖鏈的酶，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于哺乳

2、動物的N糖基化研究中。一些進一步的研究就建立在這些釋放下來的N糖鏈上。更常見的情況下，是將N糖鏈釋放后進行衍生化以改善其分離度和增強檢測靈敏度。
　　本研究建立了一種新的 N糖基化的分析方法，其中優(yōu)化了去糖基化的反應(yīng)條件和試劑，以加快 N糖鏈的釋放速度，并采用了一種能夠同時提高分離度和熒光、質(zhì)譜響應(yīng)靈敏度的新型標(biāo)記試劑（Rap iF luor-MS）來標(biāo)記釋放下來的糖鏈。此外，為了簡化數(shù)據(jù)分析難度，我們還建立了一個虛擬的N糖鏈數(shù)據(jù)

3、庫，使得復(fù)雜的N糖鏈數(shù)據(jù)能夠被自動、精確有效地識別和歸屬。最終形成一套簡單、快速、靈敏、高效的N糖基化分析方法，并將其成功應(yīng)用到了復(fù)雜糖蛋白和癌細胞表面N糖基化分析中。另外，由于目前沒有廣譜O-糖基解離酶，我們初步建立了一種有效的O-糖鏈分析方法。該方法采用了高能碰撞解離產(chǎn)物離子相關(guān)電子轉(zhuǎn)移解離（HCD-pd-ETD）二級質(zhì)譜模式對廣譜蛋白酶降解得到的糖肽進行分析，并對數(shù)據(jù)采用較新的 Byo nic軟件進行了分析，這種方法可以同時得到