PLGA納米粒經(jīng)MDCK及Caco-2細胞單層吸附、內(nèi)吞及跨膜轉(zhuǎn)運過程機理研究.pdf

1、納米粒(nanoparticle)是由天然或合成的高分子材料制成的、粒度在納米級別(1-1000nm)的固態(tài)膠體顆粒體系。在納米給藥系統(tǒng)中,藥物高度分散于由高分子材料形成的納米尺度的球狀結構中,依靠藥物自身的性質(zhì)以及載體材料的特性發(fā)揮該給藥系統(tǒng)特有的優(yōu)勢。特別對于包載難溶性藥物的口服納米給藥系統(tǒng)的研究而言,除了有效的保護藥物免受胃腸道環(huán)境的影響以及提高藥物的溶解度以外,納米給藥系統(tǒng)能夠跨越口服吸收的粘膜上皮細胞屏障,起到有效提高口服生物

2、利用度的作用。盡管目前納米技術發(fā)展迅速,有效促進了難溶性藥物的吸收與轉(zhuǎn)運,但是關于納米給藥系統(tǒng)的具體攝取及跨膜轉(zhuǎn)運作用機理研究較少。
　　本課題以納米給藥系統(tǒng)作為研究對象,建立上皮細胞單層跨膜轉(zhuǎn)運模型,綜合分析納米給藥系統(tǒng)在細胞表面的吸附,被細胞內(nèi)吞及跨膜轉(zhuǎn)運機制。
　　本課題選擇MDCK細胞和Caco-2細胞共同作為模型細胞系,并建立跨膜轉(zhuǎn)運模型。MDCK細胞與Caco-2細胞是目前藥物及制劑研究中常用模型細胞系。由于二者

3、都具有極性上皮細胞共有的結構特點,同時細胞單層頂膜上均存在多種表面受體蛋白的表達,因此MDCK細胞和Caco-2細胞可以用于有效模擬藥物或制劑經(jīng)過極性上皮細胞屏障的過程以研究其吸收與跨膜轉(zhuǎn)運機制。同時本課題選取目前具有應用廣泛性、生物可降解性和生物相容性的PLGA作為載體材料,并將其制備成PLGA納米粒用于細胞內(nèi)吞、外排及跨膜轉(zhuǎn)運機理等的研究。
　　本課題通過乳化溶劑揮發(fā)法制備了PLGA納米粒,通過單因素分析確定了用于研究的粒徑范

4、圍及多分散性。同時本課題以香豆素-6(C6)為熒光標記染料,將其包載于PLGA納米粒中,制備得到了包載有香豆素-6的PLGA納米粒(C6-PLGA-NPs)。通過體外泄漏分析以及細胞攝取后熒光強度的比較證明經(jīng)C6-PLGA-NPs可以通過熒光定位及定量很好的指示納米粒的內(nèi)吞、外排與跨膜轉(zhuǎn)運過程。
　　在PLGA納米粒與MDCK細胞單層表面的吸附研究中,可以發(fā)現(xiàn)PLGA納米粒大量吸附于MDCK細胞表面,同時這種吸附作用具有不均一性。

5、由于納米粒的吸附作用,細胞的表面形態(tài)以及微絨毛的分布發(fā)生明顯改變。利用熒光漂白恢復技術(FRAP)發(fā)現(xiàn)PLGA納米粒在細胞表面的吸附可以降低細胞質(zhì)膜的流動性。同時本課題通過薄膜分散法制備了含有卵磷脂以及膽固醇的大多囊脂質(zhì)體,用以模擬細胞質(zhì)膜的磷脂雙分子層。差示掃描量熱(DSC)發(fā)現(xiàn)PLGA納米粒顯著改變了人工細胞的能量變化曲線,表明納米粒的吸附于內(nèi)吞作用能夠改變質(zhì)膜雙分子層中磷脂分子的排列狀態(tài),進而引起能量變化差異。
　　在PLG

6、A納米粒在MDCK細胞中內(nèi)吞及外排機制研究中,發(fā)現(xiàn)納米粒能夠以大小不同的囊泡形式被細胞攝取,這種攝取作用具有時間依賴性和能量依賴性。胞內(nèi)分布發(fā)現(xiàn),納米粒會隨著內(nèi)吞時間的延長從細胞頂膜向基底膜轉(zhuǎn)移。納米粒的內(nèi)吞作用導致了細胞微絲分布的改變以及胞內(nèi)Ca2+濃度增加。內(nèi)吞機理研究表明 PLGA納米粒的內(nèi)吞以脂質(zhì)微囊和網(wǎng)格蛋白共同介導,同時受多種胞內(nèi)相關激酶的調(diào)節(jié)。C6-PLGA-NPs與胞內(nèi)細胞器的共定位分析表明納米粒內(nèi)吞入胞后會從早期內(nèi)吞體

7、向晚期內(nèi)吞體迅速轉(zhuǎn)化,并最終與溶酶體融合。
　　PLGA納米粒被MDCK細胞內(nèi)吞的同時也會被細胞外排。機理分析表明納米粒的外排機制不同于內(nèi)吞作用。高爾基體在納米粒的外排中發(fā)揮重要作用。
　　本課題利用transwell培養(yǎng)板建立了MDCK細胞跨膜轉(zhuǎn)運模型。納米?？梢钥缭郊毎麊螌?但是難以通過 transwell膜孔而到達下層接收池中,反映出納米粒經(jīng)由細胞單層的跨膜轉(zhuǎn)運是主動轉(zhuǎn)運過程。納米粒在跨膜過程中會造成部分胞間連接的打開

8、,使部分納米?？梢酝ㄟ^細胞旁路途徑跨膜。機理分析表明在內(nèi)吞與外排的不同條件下,納米粒的跨膜轉(zhuǎn)運呈現(xiàn)不同的機制。
　　本課題對PLGA納米粒在Caco-2細胞中的內(nèi)吞及跨膜轉(zhuǎn)運進行了研究。納米粒的內(nèi)吞作用具有時間、濃度及能量依賴性。內(nèi)吞途徑同樣受到脂質(zhì)微囊和網(wǎng)格蛋白的共同介導。與MDCK細胞研究類似,納米粒內(nèi)吞入胞后也會經(jīng)歷由早期內(nèi)吞體向晚期及循環(huán)內(nèi)吞體轉(zhuǎn)化的過程?？缒まD(zhuǎn)運結果表明,相比于 MDCK細胞,納米粒更難跨越細胞單層及 t

9、ranswell膜而到達接收池內(nèi)。機制分析顯示Caco-2細胞單層胞間連接受 PLGA納米粒的影響小,表明納米粒通過穿細胞途徑跨膜出胞。
　　綜上所述,通過研究PLGA納米粒與MDCK及Caco-2細胞單層的相互作用、內(nèi)吞、外排和跨膜機制,發(fā)現(xiàn)PLGA納米粒能夠通過在細胞表面的吸附引起細胞表面形態(tài)及質(zhì)膜功能的變化。納米粒的內(nèi)吞受到多種途徑的共同介導,并具有多樣性的細胞器定位特點。不僅如此,PLGA納米粒對細胞緊密連接致密程度不同的