cRGD-羧甲基殼聚糖-軟脂酸聚合物膠束的制備及體內(nèi)外抗腫瘤藥效學(xué)研究.pdf

1、目的：以殼聚糖(chitosan，CH)為基礎(chǔ)，合成具有pH敏感性的兩親性聚合物cRGD-羧甲基殼聚糖-軟脂酸(cRGD modified palmitic acid-carboxymethyl chitosan，cRGD-CMCH-PA)，并以其為載體，包載模型藥物紫杉醇(paclitaxel，PTX)，制備cRGD修飾的羧甲基殼聚糖軟脂酸載紫杉醇膠束(cRGD-CMCH-PA/PTX)，利用cRGD的靶向作用和載體材料的pH敏感性，

2、提高抗腫瘤效果。
　　方法：(1)通過親電取代反應(yīng)使殼聚糖羧甲基化，以酰胺基化反應(yīng)接枝軟脂酸和cRGD，合成CMCH-PA和cRGD-CMCH-PA。(2)通過FT-IR、1H-NMR對聚合物結(jié)構(gòu)進行表征，以芘熒光探針法測定其在不同pH的PBS溶液中的臨界膠束濃度(Critical micellar concentration，CMC);薄膜分散法制備空白膠束，測定其在不同pH下的粒徑和電位。(3)通過MTT實驗和溶血性試驗對載體

3、的安全性進行了初步評價。(4)制備載藥膠束cRGD-CMCH-PA/PTX。以包封率和載藥量為評價指標(biāo)，篩選最佳藥載比，并通過考察cRGD-CMCH-PA/PTX的粒徑分布、Zeta電位及膠束形態(tài)結(jié)構(gòu)等對其質(zhì)量進行評價;考察cRGD-CMCH-PA/PTX和Taxol(R)在不同pH環(huán)境中的體外釋放情況。(5)以人源性非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞Luc-A549為體外細(xì)胞模型，采用MTT法考察的cRGD-CMCH-PA/PTX和Taxol(R)細(xì)胞

4、毒性;分別通過共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀及活細(xì)胞工作站定性、定量地考察Luc-A549細(xì)胞對熒光染料香豆素6(Coumarin6)標(biāo)記cRGD-CMCH-PA/C6膠束的攝取情況;流式細(xì)胞儀考察PTX的不同劑型對細(xì)胞凋亡的影響。(6)建立生物自發(fā)光的皮下和原位腫瘤模型，通過生物發(fā)光檢測腫瘤所在位置和生長情況;利用近紅外小動物成像系統(tǒng)(IVIS)，分別考察載熒光染料Dir膠束CMCH-PA/Dir和cRGD-CMCH-PA/Dir在接種皮下

5、瘤和原位瘤的荷瘤小鼠體內(nèi)的靶向性。(7)通過正電子發(fā)射斷層顯像/X線計算機體層成像儀(PET/CT)和生物發(fā)光綜合考察cRGD-CMCH-PA/PTX的體內(nèi)抗腫瘤藥效學(xué)。
　　結(jié)果：(1)紅外光譜和1H-NMR譜表征結(jié)果均表明cRGD-CMCH-PA的成功合成，PA和cRGD的接枝率分別為15.0％和37.5％。(2)芘熒光探針法測得cRGD-CMCH-PA在pH7.4條件下的CMC值為2.72×10-3mg/ml，而在pH5.3

6、時的CMC值為1.40×10-2mg/ml;空白膠束cRGD-CMCH-PA在pH7.4時的粒徑為（162.9±1.5）nm，Zeta電位為(-17.2±1.6)mV，呈負(fù)電性，而在pH5.3條件下的粒徑出現(xiàn)多峰，Zeta電位明顯上升，約為(5.4±1.2)mV; MTT試驗和溶血性試驗結(jié)果顯示，所構(gòu)建的膠束具有良好的安全性。(3)對cRGD-CMCH-PA/PTX制各處方進行初步篩選，得到載體cRGD-CMCH-PA和藥物PTX最佳質(zhì)

7、量比為10∶4(w/w)，最佳處方制得膠束的粒徑(162.9±1.5)nm，Zeta電位為(-11.4±0.3)mV，形態(tài)圓整，分布均一;體外釋放實驗顯示Taxol(R)的釋放行為不受pH變化影響，而cRGD-CMCH-PA/PTX在酸性環(huán)境下釋放更為迅速，且累計釋放量增加。(4)MTT試驗結(jié)果表明與Taxol(R)相比，cRGD-CMCH-PA/PTX的IC50值更小，對A549細(xì)胞具有更高的細(xì)胞毒性，且呈現(xiàn)劑量依賴性特點;共聚焦試驗

8、表明細(xì)胞攝取隨著時間延長而增加，且與溶酶體有一定的共定位，cRGD修飾使得膠束更快容易被細(xì)胞攝取，且攝取量增大，流式細(xì)胞儀和活細(xì)胞工作站觀察攝取結(jié)果相符。細(xì)胞凋亡試驗表明PTX制成納米劑型以后，誘導(dǎo)凋亡能力增強，且在經(jīng)cRGD修飾后進一步增強。(5)體內(nèi)靶向性試驗結(jié)果顯示了cRGD-CMCH-PA/DiR對于皮下腫瘤與原位腫瘤具有較好的腫瘤靶向性。(6)體內(nèi)藥效學(xué)試驗中，生物發(fā)光與18F-FDG攝取情況均表明皮下腫瘤和原位腫瘤生長受到抑