狂犬疫苗糖蛋白及乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨免疫分析試劑的研制.pdf

1、目的:
　　本研究采用時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)研制狂犬病毒糖蛋白及甲胎蛋白和乙肝表面抗原的雙標(biāo)記定量檢測(cè)試劑，評(píng)價(jià)各項(xiàng)性能指標(biāo)，并與其它檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較，評(píng)價(jià)其在臨床檢測(cè)應(yīng)用中的可行性。
　　方法:
　　采用雙抗體夾心法研制狂犬疫苗糖蛋白及甲胎蛋白和乙肝表面抗原雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑。
　　一、人用狂犬疫苗糖蛋白定量檢測(cè)試劑的研制與應(yīng)用
　　1.狂犬病毒糖蛋白抗原的制備:根據(jù)狂犬病毒CTN株G基因

2、膜外序列設(shè)計(jì)引物，提取狂犬病毒CTN株總RNA，采用AMV酶逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，利用PCR的方法從cDNA中擴(kuò)增G基因，將該基因片段定向克隆到原核表達(dá)載體p ET32a(+)中，構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET32a/G。陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并確定表達(dá)G基因的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。SDS-PAGE和Western-blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)和分析。
　　2.人用狂犬病毒抗糖蛋白單克隆抗體的制備:以狂

3、犬疫苗制劑為抗原免疫Bal/C小鼠，效價(jià)達(dá)到1∶64000后，采用雜交瘤融合的方法制備單克隆抗體，使用狂犬病毒原液、人血清白蛋白及狂犬病毒核蛋白進(jìn)行篩選對(duì)抗體進(jìn)行初步篩選，篩出48株疑似糖蛋白單抗。
　　3.單克隆抗體的純化:用Protein G Sepharose4 Fast flow親和層析柱純化，并用BCA試劑盒測(cè)抗體濃度。
　　4.銪標(biāo)記抗體與純化:超濾管純化抗體后，按質(zhì)量比5∶1與銪標(biāo)記試劑充分混勻，25℃振蕩過夜

4、，次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化，同時(shí)收集流出液(1ml/管)，收集液逐管取樣測(cè)量熒光信號(hào)值，合并信號(hào)峰值的收集管，加10％ BSA保護(hù)劑，-20℃保存。
　　5.特異性糖蛋白抗體的篩選及配對(duì):先用狂犬病毒原液作為雙抗夾心的標(biāo)準(zhǔn)品，將48株抗糖蛋白單抗逐一包被，與另外47株銪標(biāo)抗體配對(duì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，篩出配較佳的配對(duì)組合，再用自制糖蛋白抗原和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)準(zhǔn)品，從中繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，最終篩出配對(duì)得上的單抗。

5、>　　6.參考標(biāo)準(zhǔn)品的配備用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液將糖蛋白抗原配制成0、31.25、62.5、125、250和250 mEu/L系列參考標(biāo)準(zhǔn)溶液，每瓶1ml分裝凍干4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　7.試劑性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)
　　二、采用雙抗體夾心法研制乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫定量檢測(cè)分析試劑。
　　1.用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將AFP抗原配制成系列濃度為:0mIU/L、2 mIU/L20mIU/L、200 mIU/L、1000 mIU

6、/L和2000 mIU/L;同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將HBsAg抗原配制成系列濃度為:0μg/L、0.4μg/L、2μg/L、10μg/L、50μg/L和300μg/L;再將兩種母液分別從低濃度到高濃度按1∶1混勻，最后AFP(mIU/L)/ HBsAg（μg/L）標(biāo)準(zhǔn)品濃度為:0/0、1/0.2、10/1、100/5、500/25和1000/150;每瓶1ml分裝凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2.固相包被抗體用包被液將AFP和HBsAg包

7、被抗體稀釋后，一同加入96微孔板中包被，37℃震蕩2小時(shí)后，4℃過夜，37℃封閉3小時(shí)，真空抽干，4℃保存。
　　3.Eu3+標(biāo)記抗體制備超濾管純化抗體后，按質(zhì)量比5∶1與銪標(biāo)記試劑充分混勻，25℃振蕩過夜，次日過SephadexTMG-50凝膠層析柱純化，同時(shí)收集流出液(1ml/管)，逐管測(cè)量熒光信號(hào)值，合并峰管，加10％ BSA保護(hù)劑，-20℃保存。
　　4.Sm3+標(biāo)記抗體制備超濾管純化抗體后，按質(zhì)量比2∶1與釤標(biāo)記試

8、劑充分混勻，25℃振蕩過夜，次日過SephadexTM G-50凝膠層析柱純化，同時(shí)收集流出液(1ml/管)，然后逐管測(cè)定熒光信號(hào)值，合并峰管，加入10％濃度的BSA作保護(hù)劑，-20C保存。
　　5.試劑性能指標(biāo)的評(píng)價(jià)
　　5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
　　以自制試劑中參考標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，信號(hào)值的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，由雙對(duì)數(shù)數(shù)學(xué)模型Log-Log函數(shù)處理，繪圖軟件采用OriginPro7.5 SR1(Microcal，U

9、SA)。
　　5.2 靈敏度實(shí)驗(yàn)
　　以零參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測(cè)量20次，計(jì)算其均值及標(biāo)準(zhǔn)差。以其測(cè)定值的均值加上2倍的標(biāo)準(zhǔn)差所得信號(hào)值再減去本底信號(hào)值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算所得出的濃度，即為其靈敏度。
　　5.3 準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)
　　以自制參考品為對(duì)照品，計(jì)算試劑參考標(biāo)準(zhǔn)品的實(shí)測(cè)濃度與標(biāo)示濃度的比值。
　　5.4 精密度實(shí)驗(yàn)
　　精密度實(shí)驗(yàn)采用自制的低、中、高3個(gè)質(zhì)控品（質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）進(jìn)行測(cè)定，分析內(nèi)

10、精密度實(shí)驗(yàn)設(shè)置復(fù)孔，分析間精密度實(shí)驗(yàn)設(shè)多次測(cè)定，計(jì)算各質(zhì)控品檢測(cè)值的均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差及CV值。
　　5.5 稀釋線性實(shí)驗(yàn)
　　使用標(biāo)準(zhǔn)緩沖液將已知濃度的血清樣本從1/2至1/32連續(xù)倍比稀釋進(jìn)行平行度分析。
　　5.6 干擾實(shí)驗(yàn)
　　檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)研發(fā)的分析試劑在干擾性物質(zhì)（溶血、高血脂、高膽紅素）存在的情況下檢測(cè)標(biāo)本的準(zhǔn)確性。按試劑操作說明書對(duì)加入了血紅蛋白、甘油三酯和膽紅素的陽性標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其回收率。
　

11、　5.7 與國外試劑的比較實(shí)驗(yàn)
　　同時(shí)采用自制試劑及雅培化學(xué)發(fā)光兩種試劑盒檢測(cè)血清樣本，使用統(tǒng)計(jì)軟件分析測(cè)值相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　一、成功從狂犬CTN株獲取目的基因，并構(gòu)建p ET32a/G重組質(zhì)粒，重組蛋白在BL21(DE3)宿主菌中以包涵體的形式表達(dá)，通過包涵體洗滌、Ni離子親和層析以及透析復(fù)性后抗體鑒定得到了純度較高的有活性的狂犬病毒糖蛋白抗原。采用單克隆抗體制備的經(jīng)典方案，以狂犬疫苗制劑免疫小鼠，取脾進(jìn)行

12、細(xì)胞融合成功制備出48株疑似狂犬病毒糖蛋白單克隆抗體細(xì)胞株，進(jìn)一步采用糖蛋白抗原篩選出符合使用要求的特異性糖蛋白單克隆抗體配對(duì)組合（S036-S053EU3+）。并以特異性糖蛋白單克隆抗體配對(duì)組合(S036-S053EU3+)為基礎(chǔ)成功研制出狂犬疫苗糖蛋白時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑，自制試劑參考品實(shí)測(cè)濃度與標(biāo)示濃度的比值在0.90-1.10之間;靈敏度為0.098 mEU/mL，在樣品濃度超過2000 mEU/mL將出現(xiàn)HOOK效應(yīng);試劑

13、分析內(nèi)變異系數(shù)和分析間變異系數(shù)均不超過10％;與狂犬核蛋白無交叉反應(yīng);189份狂犬病毒樣品采用自制試劑和武漢病毒研究所糖蛋白ELISA檢測(cè)試劑盒武漢進(jìn)行平行檢測(cè)，對(duì)所測(cè)數(shù)值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示兩種方法所得的數(shù)值相關(guān)性良好:Y=1.00X+1.38，R2=0.912，P＜0.0001;通過效力實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)做出糖蛋白濃度與參考疫苗和各樣品疫苗的線性關(guān)系，并計(jì)算出TRFIA所測(cè)得的疫苗效力值(T-NIH)。同時(shí)對(duì)TRFIA和NIH動(dòng)物法所

14、測(cè)得的39份疫苗效力值進(jìn)行趨勢(shì)和相關(guān)性分析，結(jié)果兩種方法所得的數(shù)值趨勢(shì)一致，相關(guān)性良好:Y=0.930X+0.114，R2=0.903，P＜0.0001，兩種方法所測(cè)的數(shù)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示:t0.05/2,38=-1.223，P=0.229＞0.05，表明兩種方法所測(cè)的數(shù)值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　二、自制乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫免疫分析試劑在檢測(cè)AFP和HBsAg的分析靈敏度分別為0.09 mIU/L和

15、0.01μg/L。檢測(cè)范圍分別為1-1000 mIU/L和0.2-150μg/L，在檢測(cè)AFP時(shí)分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別為3.3-4.1％和5.7-7.2％，而在檢測(cè)HBsAg時(shí)分析內(nèi)和分析間變異系數(shù)分別為2.9-3.9％和4.9-6.8％。自制試劑臨床血清樣本測(cè)值同化學(xué)發(fā)光法測(cè)值相關(guān)性良好(R2AFP=0.989，P＜0.0001;R2HBsAg=0.988，P＜0.0001)，兩種方法所測(cè)的數(shù)值進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示:tAFP0

16、.05/2,111=-0.846，P=0.399＞0.05; tHBsAg0.05/2,82=0.557，P=0.579＞0.05，可以認(rèn)為兩種方法所測(cè)數(shù)值的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論:
　　上述結(jié)果表明本研究研制的狂犬疫苗糖蛋白及乙肝表面抗原與甲胎蛋白雙標(biāo)記時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑的各項(xiàng)指標(biāo)（準(zhǔn)確性、靈敏度、精密度和抗干擾性等）均達(dá)到檢測(cè)試劑的使用要求，狂犬疫苗糖蛋白時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑疫苗樣品測(cè)值與NIH法測(cè)值有良